MMP-12及其抑制因子TIMP-1在基底細胞癌和鱗狀細胞癌患者皮損中的表達

司海鵬 高麗麗 王劍蓉

基底細胞癌(basal cell carcinoma, BCC)和皮膚鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)統稱為非黑色素瘤皮膚癌(non-melanomatous skin cancer, NMSC)，兩者皆起源于表皮角質形成細胞，具有較高的發生率，給患者帶來身體和精神的雙重壓力[1]。基質金屬蛋白酶12(matrix metalloproteinase-12，MMP-12，也稱巨噬細胞金屬彈力酶)能夠廣泛降解如IV型膠原、纖連蛋白、層黏連蛋白、玻連蛋白、硫酸軟骨素和肝素鈉等細胞外基質，據報道，MMP-12具有抗腫瘤發生和促腫瘤發生的雙重效應[2,3]。基質金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP)可以特異性地結合MMPs進而發揮調節作用，是MMP-12主要的抑制劑。多數研究表明除了乳腺癌、結腸癌等常見腫瘤[4,5]，在皮膚惡性黑色素瘤及皮膚鱗狀細胞癌中[6-8]MMP表達增高并促進腫瘤進展，TIMP對MMP具有較強抑制作用，而在NMSC中二者的表達及意義報道較少，本研究應用免疫組化法檢測正常皮膚、BCC患者皮膚及SCC患者皮膚組織中MMP-12及TIMP-1的表達，探討其與NMSC發生的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年1月至2017年12月間我院門診及住院患者的基底細胞癌及皮膚鱗狀細胞癌手術切除標本共56例，均經組織病理證實。其中BCC患者31例，年齡36～83歲，平均61.25歲，男17例，女14例；頭面部24例，軀干部7例。SCC患者25例，年齡29～82歲，平均61.2歲，男15例，女10例；其中頭頸部10例，外生殖器8例，四肢5 例，軀干2例；按分化程度分為高分化組10例，中分化組8例，低分化組7例。另取我院皮膚科及外科手術切除正常皮膚20例作為對照。

1.2 試劑 鼠抗人多克隆抗體MMP-12、鼠抗人單克隆抗體TIMP-1購自廣州萊德爾公司。枸櫞酸抗原修復液、DAB顯色液均購自武漢博士德。

1.3 免疫組化 每個組織塊進行3 μm連續切片，經脫蠟、H2O2(過氧化氫)封閉、熱修復后PBS洗滌3次，血清封閉，滴加一抗，一抗37℃孵育1 h后，PBS清洗3次，滴加二抗試劑，最后經DAB顯色、蘇木素復染，用已有陽性片子作陽性對照，使用不加一抗片子作為陰性對照。結果判斷標準：胞質內出現黃色顆粒狀物質判為陽性，并按著色強弱分級：無著色為0分，淺黃色劃為1分，深黃色為2分，棕褐色為3分。隨機選取5個視野，計算陽性細胞所占的百分比均值：無陽性細胞為0分，陽性細胞1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，75%以上為4分。將上述兩項評分標準相加可得表達強度積分：<2分為陰性(-)，≥2分且<3分為弱陽性(+)，≥3分且<4分為陽性(++)，≥4分為強陽性(+++)。

1.4 統計學方法 應用SPSS 19.0軟件對結果進行數據分析，計量資料和計數資料分別采用方差分析和卡方檢驗，P<0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1 MMP-12與TIMP-1蛋白表達情況 MMP-12在正常對照表皮中幾乎不表達，在真皮區域的成纖維樣細胞呈弱陽性表達。31例BCC中MMP-12陽性表達為14例(45.2%)，呈弱陽性彌散于癌巢。25例SCC患者中陽性表達20例(80%)，陽性細胞在癌巢內表達，陽性較強者主要位于癌巢中心，癌巢增殖區域反而著色略淡，也可觀察到癌巢周圍間質中部分巨噬細胞、成纖維樣細胞有少量陽性表達。TIMP-1在正常對照表皮中呈現大量陽性表達，31例BCC患者中有21例呈陽性表達(67.7%)。25例SCC患者中TIMP-1陽性表達15例(60%)，高分化的SCC可見癌巢區域大片的表達，而在低分化者中表達減弱。BCC、SCC與正常組比較，均具有統計學差異。見表1及圖1。

表1 MMP-12與TIMP-1在正常組織、BCC及SCC中的陽性表達

注：*與正常組比較，P<0.05

2.2 不同分化程度SCC中MMP-12與TIMP表達情況 MMP-12蛋白表達水平隨著腫瘤分級的增高而增高，即在低分化鱗癌的表達明顯高于高分化組，而TIMP-1蛋白表達與之相反，在高分化鱗癌的表達明顯高于低分化，比較有統計學差異(P<0.05)。見表2。

表2 SCC不同分化程度中MMP-12與TIMP-1表達情況

注：與對應分類比較，*P<0.05

3 討論

皮膚癌是迄今造成最普遍危害的癌癥之一，根據其發生的細胞和臨床表現來命名，最常見的三種類型是基底細胞癌、鱗狀細胞癌及惡性黑色素瘤。基底細胞癌、鱗狀細胞癌都來自表皮的角質形成細胞，每年全球非黑色素瘤皮膚癌(NMSC)發生兩百多萬例，據估算，在未來30年發生率可能增加一倍。BCC的發生率占NMSC發生率的80%～85%，生長緩慢，極少轉移到其他器官[9]。SCC發生占NMSC的15%～20%，侵襲性強，如未得到及時治療則會侵犯周圍正常的皮膚、皮下組織及肌肉，引起較為嚴重的損害[10]，NMSC即使未發生轉移也會造成明顯的毀損，造成生理、心理及經濟負擔，降低人們的生活質量[11]。這二種腫瘤均為老年人多發，BCC女性患者較多，SCC男性患者略多[12]，最常見于頭面部等曝光部位，目前，NMSC治療首選手術切除，但是易復發，SCC和BCC發生浸潤轉移及復發的一個主要原因是基底膜完整性被破壞。

MMPs主要由單核巨噬細胞、中性粒細胞等細胞合成分泌，可降解細胞外基質的多種成分和基底膜。研究表明，在腫瘤細胞的惡性表型和侵襲轉移表型中MMPs為高表達狀態[13]。在乳腺癌、結腸癌、前列腺癌和口腔癌等也發現MMP-2及MMP-9表達上調[14]。在腫瘤轉移過程中，MMPs可以通過破壞局部組織的正常生理結構，促進腫瘤生長和發展，促進腫瘤細胞各類生長因子的分泌,加快腫瘤細胞的增殖。此外MMPs還可協助腫瘤細胞發生免疫逃逸[15]及促進腫瘤的新生血管迅速形成[16]。MMP-12是MMPs家族中的一員，又稱巨噬細胞金屬彈性酶(HME)，一方面它在分解纖溶酶原和V型膠原等細胞外基質的過程中，可促進產生抑制血管生成的血管抑素和內抑素，從而抑制腫瘤的生長和侵襲[2]；另一方面，在分解膠原和纖維蛋白等細胞外基質過程中，能誘導MMP-2及MMP-9的表達，促進血管生成及促進腫瘤侵襲和轉移[3]，所以MMP-12在腫瘤進展上的作用是雙向的。在皮膚癌中，相對正常皮膚，MMP-12在惡性黑色素瘤中表達增加，與其侵襲性相關[17]。在SCC和BCC的研究中發現，MMP-12表達在腫瘤細胞和巨噬細胞上，SCC中MMP-12的表達明顯高于BCC，提示MMP-12的表達水平在兩者中存在差異，與其侵襲性有關。本實驗中MMP-12表達的免疫組化結果與前人實驗[18]類似，BCC中的MMP-12陽性表達45.2%，SCC患者中陽性表達80%，在SCC及BCC具有明顯差異；而且MMP-12蛋白表達水平隨著腫瘤分級的增高而增高，即在低分化鱗癌的表達明顯高于高分化組，表明了MMP-12與腫瘤的轉移能力關聯密切。

TIMPs由成纖維細胞、角質形成細胞以及成骨細胞等分泌產生。TIMPs對MMPs活性的抑制作用是控制MMPs活性的重要機理，TIMPs主要通過控制腫瘤的生長與增殖、侵襲與轉移、血管生成及細胞凋亡來發揮抑制腫瘤功效。在增殖的抑制及對凋亡的促進方面，報道有所矛盾[14]。多項研究表明在皮膚癌、肺癌、大腸癌等惡性腫瘤中，TIMP-1陽性表達率明顯增高，其過度表達則預后不良的報道較多[19]。而在頭頸部鱗狀細胞癌中經半定量RT-PCR法檢測，發現在腫瘤組織中TIMP-1表達下降[6，20]。本實驗中TIMP-1陽性表達在BCC患者中有67.7%，在SCC患者中有60%，以上結果表明在SCC中TIMP-1的表達較BCC少，而且在高分化鱗癌的表達明顯高于低分化組，比較有統計學差異，表明隨著侵襲度的增加，TIMP-1表達逐漸減少。

綜上所述，本文就MMP-12、TIMP-1 在NMSC中表達做了初步的研究。其中MMP-12及其抑制劑與SCC的組織分化程度和浸潤轉移密切相關，可以作為皮膚SCC早期轉移和侵襲性的一個指標，而在BCC中其機理還有待探索，可能與其他MMPs的表達具有關聯性。