Notch信號(hào)通路在咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠模型中的表達(dá)

潘 敏 王小康 趙 莎 林向飛 朱曉芳

銀屑病(psoriasis)是一種常見(jiàn)的慢性炎癥性疾病，典型表現(xiàn)為身體多處皮膚表面的鱗屑樣紅斑。在歐洲和美國(guó)，發(fā)病率接近2%，其他地區(qū)相對(duì)較少。2010年中國(guó)六省市銀屑病流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)人患病率為0.47%。在銀屑病發(fā)病機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞活化及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是銀屑病發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)于銀屑病的發(fā)生和發(fā)展起著重要作用[1-3]。研究表明，在銀屑病相關(guān)的信號(hào)通路中，Notch信號(hào)通路與角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和凋亡與銀屑病發(fā)生關(guān)系密切，其中受體Notch1-4、配體Jagged-1、目標(biāo)基因Hes1均為Notch信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子[4-6]。本研究通過(guò)建立咪喹莫特(imiquimod，IMQ)誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型，觀測(cè)Notch1、Notch2、配體Jagged-1、目標(biāo)基因Hes-1等在模型小鼠皮損和對(duì)照組小鼠皮損中的表達(dá)水平，從而進(jìn)一步明確Notch信號(hào)通路在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性BALB/c小鼠，6～8周齡，購(gòu)買(mǎi)于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物室。

1.1.2 試劑及儀器 凡士林乳膏(南昌白云藥業(yè)有限公司)，5%咪喹莫特乳膏(四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司)，薇婷護(hù)膚脫毛膏[利沾時(shí)家化(中國(guó))有限公司]，抗Notch1-2、Jagged-1及Hes-1蛋白單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)，通用型二抗及抗體稀釋液(美國(guó)Abcam公司);Trizol RNA提取試劑((北京BioTeke公司);iScript cDNA kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)BioRad公司)；iTaqTMSYBR-Green Real Time PCR試劑盒(美國(guó)ABI公司)；DAB試劑盒(北京中衫金橋生物有限公司)；顯微鏡(OLYMPUS BX43)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立 取BALB/c小鼠30只，隨機(jī)分為IMQ模型組20只和空白對(duì)照組10只，用戊巴比妥鈉80 mg/kg腹腔注射麻醉，小心剃去小鼠背部中央?yún)^(qū)域的被毛，溫和型脫毛膏脫去毳毛，形成約2 cm×3 cm暴露區(qū)域。空白對(duì)照組：小鼠背部抹凡士林乳膏50 mg/cm2在脫毛部位，1次/d，連續(xù)7 d；IMQ模型組：小鼠背部抹按50 mg/cm2劑量均勻涂在脫毛部位，1次/d，連續(xù)7 d。

1.2.2 HE染色觀察皮損病理變化 于造模及處理后第8天小鼠拉頸處死后剪取小鼠皮損處皮膚甲醛固定，石蠟包埋，采用HE染色觀察IMQ模型組及空白對(duì)照組皮膚病理變化。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)檢測(cè)IMQ模型組及空白對(duì)照組皮膚受體Notch1、Notch2、配體Jagged-1、目標(biāo)基因Hes-1的mRNA表達(dá)水平 用RNA提取試劑盒提取組織樣本中總RNA，用iScript cDNA kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表1，β-actin作為內(nèi)參。按照iTaqTMSYBR-Green Real Time PCR試劑盒要求，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA作為模板進(jìn)行兩步法PCR反應(yīng)：預(yù)變性95℃ 1 min；循環(huán)時(shí)95℃變性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行50個(gè)循環(huán)。檢測(cè)數(shù)據(jù)應(yīng)用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析，檢測(cè)目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 免疫組化觀察皮損處受體Notch1、Notch2、配體Jagged-1、Hes-1的蛋白表達(dá)水平 采用免疫組化SABC法檢測(cè)IMQ模型組及空白對(duì)照組皮損處受體Notch1、Notch2、配體Jagged-1、Hes-1的蛋白表達(dá)水平。常規(guī)石蠟包埋的皮膚組織脫蠟、水化，切片經(jīng)高壓抗原修復(fù)5 min，甲醇-過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min，加入稀釋的一抗Notch1(1∶100)、Notch2(1∶100)、Jagged-1(1∶100)、Hes-1(1∶100)，4℃孵育過(guò)夜;滴加二抗，常溫孵育30 min； DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，酒精梯度脫水，二甲苯透明和中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察和拍片。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比( 5個(gè)×400倍隨機(jī)視野的陽(yáng)性細(xì)胞百分比平均值) 及染色強(qiáng)度( 多數(shù)細(xì)胞的染色情況積分) 進(jìn)行綜合評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比:無(wú)陽(yáng)性為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。染色強(qiáng)度按顏色深淺計(jì)分:無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項(xiàng)相加為綜合評(píng)分:0分為陰性，1～3分為弱陽(yáng)性(+)，4～5分為中度陽(yáng)性(++)，6～7分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用t檢驗(yàn)、Ridit分析法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IMQ模型組及空白對(duì)照組皮膚病理變化 HE染色顯示，空白對(duì)照組皮膚菲薄，僅見(jiàn)2～3層形態(tài)正常的細(xì)胞；IMQ模型組小鼠表皮明顯增厚，表皮層細(xì)胞數(shù)量增加，表皮層向下延伸，可見(jiàn)明顯角化過(guò)度伴有角化不全，棘層細(xì)胞顯著增厚，真皮炎癥大量浸潤(rùn)，表現(xiàn)為典型銀屑病樣改變(圖1)。

2.2 IMQ模型組較空白對(duì)照組皮膚的受體Notch1、Notch2、配體Jagged-1、目標(biāo)基因Hes-1的mRNA表達(dá)水平升高 IMQ模型組的Notch1的mRNA水平高于空白對(duì)照組，t=3.550，P<0.05；IMQ模型組的Notch2的mRNA水平高于空白對(duì)照組，t=3.575，P<0.05；IMQ模型組的Jagged-1的mRNA水平高于空白對(duì)照組，t=3.732，P<0.05；IMQ模型組的Hes-1的mRNA水平高于空白對(duì)照組，t=3.506，P<0.05(圖2)。

2.3 IMQ模型組較空白對(duì)照組皮膚的受體Notch1、Notch2、配體Jagged-1、目標(biāo)基因Hes-1的蛋白表達(dá)水平升高 在光鏡下，Notch1、Notch2、Jagged-1、Hes-1陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)為表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中出現(xiàn)淺黃色至棕黃色均勻或顆粒沉著。IMQ模型組皮損組織表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中Notch1、Notch2、Jagged-1、Hes-1的表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于空白對(duì)照組組織表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ，見(jiàn)表2。Notch1、Notch2、Jagged-1、Hes-1在IMQ模型組皮膚表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)以中度陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性為主，在空白對(duì)照組表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)以陰性、弱陽(yáng)性為主。見(jiàn)圖3～6。

表1 引物序列

圖1 IMQ模型組及空白對(duì)照組皮膚組織病理(HE，×100) 1a：空白對(duì)照組皮膚菲薄，僅見(jiàn)2～3層形態(tài)正常的細(xì)胞；1b：IMQ模型組小鼠表皮明顯增厚，表皮層細(xì)胞數(shù)量增加，表皮層向下延伸，可見(jiàn)角化過(guò)度、角化不全、棘層細(xì)胞顯著增厚，真皮炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)

圖3 IMQ模型組及空白對(duì)照組皮膚Notch1的表達(dá)(免疫組化，×100) 3a：空白對(duì)照組表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)以陰性、弱陽(yáng)性為主；3b：IMQ模型組皮膚表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)以中度陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性為主 圖4 IMQ模型組及空白對(duì)照組皮膚Notch2的表達(dá)(免疫組化，×100) 4a：空白對(duì)照組表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)以陰性、弱陽(yáng)性為主；4b：IMQ模型組皮膚表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)以中度陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性為主 圖5 IMQ模型組及空白對(duì)照組皮膚Jagged-1的表達(dá)(免疫組化，×100) 5a：空白對(duì)照組表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)以陰性、弱陽(yáng)性為主；5b：IMQ模型組皮膚表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)以中度陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性為主 圖6 IMQ模型組及空白對(duì)照組皮膚Hes-1的表達(dá)(免疫組化，×100) 6a：空白對(duì)照組表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)以陰性、弱陽(yáng)性為主；6b：IMQ模型組皮膚表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)以中度陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性為主

表2 IMQ模型組及空白對(duì)照組皮膚Notch1、Notch2、Jagged-1、Hes-1的表達(dá)

3 討論

銀屑病是一種常見(jiàn)的以角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增生、角化不全、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和新生血管形成為主要組織病理改變的慢性炎癥性皮膚病，以鱗屑性紅斑為典型皮損表現(xiàn)，其病因和發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前為止仍未完全闡明[7]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)改變與銀屑病的表皮細(xì)胞過(guò)度增生、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和新生血管形成發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[8,9]。Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路由4種受體(Notch1-4)、5種配體(Jagged-1、Jagged-2、Delta-like-1、Delta-like-3、Delta-like-4)和DNA結(jié)合蛋白3部分組成。Notch信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中,Notch信號(hào)蛋白共經(jīng)歷了3次剪切過(guò)程。Notch基因編碼的Notch受體前體蛋白在核糖體合成以后，首先在高爾基體被Fringe糖基轉(zhuǎn)移酶切割為兩個(gè)片段，轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜后組成異二聚體形成成熟的Notch受體。當(dāng)Notch配體與受體結(jié)合后觸發(fā)Notch信號(hào)的活化，Notch受體相繼發(fā)生兩次蛋白水解后生成活性片段Notch細(xì)胞內(nèi)段(NICD)，NICD釋放入胞漿后由細(xì)胞內(nèi)體通過(guò)內(nèi)吞作用將轉(zhuǎn)運(yùn)至核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄抑制物CSL、Foxp3結(jié)合，進(jìn)一步激活Bcl2、Hes1，Hes5等下游靶基因家族，從而促進(jìn)細(xì)胞分化[10]。因此，受體Notch1、Notch2、配體Jagged、目標(biāo)基因Hes1均為Notch信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子。

咪喹莫特(imiquimod, IMQ)，是一種很強(qiáng)的免疫激活劑，臨床上常用作由人乳頭狀瘤引起的生殖道和肛周疣的局部治療。IMQ是Toll 樣受體7(Toll-like receptor7，TLR7)的激動(dòng)劑，當(dāng)其被激活后，能引起免疫調(diào)控因子的改變，進(jìn)一步產(chǎn)生炎性反應(yīng)及損傷。當(dāng)用咪喹莫特涂抹動(dòng)物皮膚后，出現(xiàn)鱗屑、紅斑、皮膚褶皺及增厚，呈現(xiàn)銀屑病樣皮損[11]。因此咪喹莫特皮損模型也是目前熱點(diǎn)研究的銀屑病樣皮損動(dòng)物模型之一[12]。

我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)提示IMQ外用誘導(dǎo)銀屑病樣皮損在連續(xù)用藥后第7天達(dá)到高峰，然后逐漸改善。因此我們以IMQ造模小鼠，同時(shí)建立空白對(duì)照組，在試驗(yàn)第8天采集試驗(yàn)所需標(biāo)本，研究發(fā)現(xiàn)，IMQ可成功誘導(dǎo)銀屑病小鼠模型，RT-PCR結(jié)果提示IMQ模型組較空白對(duì)照組皮膚的受體Notch1、Notch2、配體Jagged-1、目標(biāo)基因Hes-1的mRNA表達(dá)水平升高，免疫組化結(jié)果提示IMQ模型組較空白對(duì)照組皮膚的受體Notch1、Notch2、配體Jagged-1、目標(biāo)基因Hes-1的蛋白表達(dá)水平升高。因此可以認(rèn)為，IMQ誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型中Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)增加， Notch信號(hào)通路傳導(dǎo)活化信號(hào)的能力增強(qiáng),可以推斷Notch信號(hào)通路活化參與了銀屑病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象為咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣皮炎小鼠模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與國(guó)外關(guān)于銀屑病病人血液、皮損的Notch表達(dá)方面的研究結(jié)果趨勢(shì)一致[13,14]，證實(shí)了咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣皮炎小鼠模型作為銀屑病動(dòng)物模型的可靠性。本實(shí)驗(yàn)就銀屑病相關(guān)的Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行了初步研究，但是銀屑病的病因和發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，多種信號(hào)通路異常參與其中，Notch信號(hào)通路的其他因子以及其與其他類型信號(hào)通路(如NF-κB、SMAD等)在銀屑病發(fā)病機(jī)制方面的串話關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。