人參皂苷Rg1對過氧化損傷人臍帶間充質干細胞的保護作用及機制

種宗雷,楊曉倩,肖以磊,呂甲濤,侯磊,許鵬,朱偉杰

(1 聊城市人民醫院腦科醫院，山東聊城252000；2濟南軍區總醫院)

干細胞移植是治療脊髓損傷等神經損傷性疾病的研究熱點，而移植入的干細胞異常衰老[1]一直是影響移植治療效果的難題。研究發現，脊髓損傷伴隨脊髓水腫進一步減少血流[2]，脊髓損傷微環境中自由基介導的脂質過氧化作用造成神經結構和功能的嚴重損傷，甚至使神經功能永久性喪失[3]。自由基作用于脂質發生過氧化反應，會損傷植入的干細胞[4，5]。2012年12月～2018年4月，本研究通過觀察人參皂苷Rg1對過氧化損傷人臍帶間充質干細胞(hUCMSCs)形態、增殖、衰老、細胞因子分泌、胞內蛋白質表達的影響，探討Rg1對hUCMSCs有無保護作用及可能的作用機制，以提高干細胞對神經損傷的治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料 hUCMSCs由聊城市人民醫院中心實驗室提供。人參皂苷Rg1購自上海雅吉生物科技有限公司，純度大于95%;人腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司,β-半乳糖苷酶原位染色試劑盒、CCK-8試劑盒、磷酸-p38分裂原激活的蛋白激酶(p-p38 MAPK)抗體、磷酸化應激活化蛋白激酶(p-JNK/SAPK)抗體、二氨基聯苯胺(DAB)辣根過氧化物酶顯色試劑盒購自碧云天生物技術研究所。

1.2 hUCMSCs鑒定 采用流式細胞術檢測hUCMSCs表面抗原。0.125%胰蛋白酶消化P5代細胞，加入PBS離心后去掉胰蛋白酶，調整細胞濃度達1×109/L以上。將待檢細胞樣品分裝后,陰性對照管加入鼠IgG-FITC、IgG-PE，其他管分別加入鼠抗人CD105-FITC、CD29-PE、CD45-FITC、CD44-FITC、HLA-DR-PE和CD34-PE，各20 μL，室溫孵育30 min后，流式細胞儀檢測。

1.3 Rg1濃度篩選、細胞分組及處理 采用CCK-8比色法。取生長狀態良好的P5～P6代hUCMSCs，分別在不同Rg1濃度(0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μmol/L)的培養基中培養66 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，培養4 h，用酶標儀在450 nm處測定吸光度。將hUCMSCs分為陰性對照組(以3.3×105個/mL細胞密度接種到含50 ng/mL干細胞生長因子、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的培養基)，模型組(陰性對照組條件下培養，細胞融合達80%時加入1.6 μmol/L H2O2)，Rg1低、中、高劑量組(模型組條件下培養30 min后，加入Rg1各0.5、4、32 μmol/L，繼續培養36 h)，陽性對照組(模型組條件下培養30 min后，加入220 μmol/L維生素C，繼續培養36 h)。

1.4 細胞增殖活性的檢測 采用CCK-8比色法。96孔板中按分組每孔加入3.3×105/mL細胞懸液200 μL，培養細胞融合至80%時，加入CCK-8溶液20 μL，細胞培養箱內孵育4 h，用酶標儀在450 nm處測定吸光度(OD值)。

1.5 培養上清TNF-α水平檢測 采用ELISA法。收集細胞培養上清液，用人TNF-α ELISA試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司)檢測。將TNF-α標準品加入稀釋液150 μL后，加于酶標板孔底部，37 ℃溫育30 min，加滿洗滌液5次，加入酶標試劑溫育、洗滌，加入顯色劑，37 ℃避光顯色15 min，加終止液，測量各孔的吸光度(OD值)。

1.6 衰老hUCMSCs百分比的檢測 采用β-半乳糖苷酶染色法。收集各組細胞，加β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定10 min，PBS洗滌3次，每次3 min，加入染色工作液，37 ℃孵育20 min或更長時間，直至部分細胞的顏色變藍。通過400倍油鏡顯微鏡下觀察，在三個獨立的區域中計數超過400個細胞來計數β-半乳糖苷酶染色陽性細胞。

1.7 hUCMSCs中p-p38蛋白表達檢測 采用免疫組化法。各組細胞用固定液固定后，免疫染色洗滌液洗滌兩次，滴加封閉液3% H2O2封閉60 min；滴加p-p38 MAPK抗體(1∶500)，37 ℃孵育過夜，PBS沖洗；滴加二抗，37 ℃孵育15 min，PBS沖洗;DAB顯色液3～5 min,顯微鏡下觀察，使用Image-Pro Plus 6.0分析各蛋白的積分光密度值。

1.8 hUCMSCs中p-JNK蛋白表達的檢測 采用Western blotting法。各組細胞(1×106個)加裂解液100 μL，冰上裂解30 min;細胞置于1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心10 min，收集上清；每孔上樣蛋白質約40 μg，10% SDS-PAGE電泳，轉膜；封閉液室溫封閉1 h;分別加入p-JNK的多克隆抗體4 ℃過夜；加入二抗室溫孵育1 h;ECL試劑顯色，圖像分析系統分析各組的積分光密度值。

2 結果

2.1 hUCMSCs的鑒定結果 流式細胞術檢測結果顯示hUCMSCs高表達CD29、CD44、CD105等間充質細胞標志。

2.2 Rg1對H2O2損傷的hUCMSCs增殖的影響 陰性對照組貼壁細胞明顯增大并分裂增殖，呈長梭形，可鋪滿板底。模型組僅有少量的細胞貼壁生長，邊緣圓潤。Rg1低劑量組僅有少量的細胞貼壁生長，邊緣較圓潤。Rg1中劑量組hUCMSCs長梭形。Rg1高劑量組貼壁細胞明顯增大并分裂增殖，呈長梭形，可鋪滿板底。陰性對照組、模型組、Rg1低劑量組、Rg1中劑量組、Rg1高劑量組、陽性對照組OD值分別為0.93±0.09、0.83±0.10、0.85±0.12、0.88±0.11、0.92±0.08、0.91±0.09，與陰性對照組相比，模型組、Rg各劑量組OD值降低(P均<0.05)；與模型組相比，Rg1低、中、高劑量組OD值逐級升高(P均<0.05)；與陽性對照組相比，Rg1高劑量組OD值增加(P<0.05)。與Rg1低、中劑量組比較，陽性對照組OD值升高(P均<0.05)。

2.3 各組p-JNK、p-p38蛋白及TNF-α表達比較 與陰性對照組相比，模型組、Rg1各劑量組p-JNK、p-p38蛋白及TNF-α表達升高(P均<0.05)；與模型組相比，Rg1低、中、高劑量組p-JNK蛋白、p-p38蛋白、TNF-α表達量逐級減小(P均<0.05)；與陽性對照組相比，Rg1高劑量組p-JNK蛋白、p-p38蛋白、TNF-α表達降低(P均<0.05)。與Rg1低、中劑量組比較，陽性對照組p-JNK、p-p38蛋白及TNF-α表達降低(P均<0.05)。見表1。

表1 各組p-JNK、p-p38蛋白及TNF-α表達比較

2.4 各組衰老hUCMSCs百分比比較 陰性對照組、模型組、Rg1低劑量組、Rg1中劑量組、Rg1高劑量組、陽性對照組衰老hUCMSCs百分比分別為6.53%±0.51%、52.10%±4.20%、31.62%±1.87%、22.23%±3.10%、6.12%±0.41%、21.62%±1.57%。與陰性對照組相比，模型組、Rg1各劑量組衰老hUCMSCs百分比升高(P均<0.05)；與模型組相比，Rg1低、中、高劑量組衰老hUCMSCs百分比降低(P均<0.05)；與陽性對照組相比，Rg1高劑量組衰老hUCMSCs百分比減少(P<0.05)。與Rg1低、中劑量組比較，陽性對照組衰老hUCMSCs百分比減少(P均<0.05)。

3 討論

人參含有多種成分，各成分均有重要作用，如皂苷Rh2、Rg3抗腫瘤作用[6,7]，Rb1可促進荷爾蒙分泌[8]、促進生物合成、增強免疫力、保護細胞、抗疲勞、抗氧化等[8～11]。Rg1對干細胞的作用引起了廣泛關注，能夠顯著提升雪旺細胞等干細胞增殖、再生[12]，能夠促進造血干祖細胞增殖[13]等。Rg1抗炎機制與大腦黑多巴胺能神經元的保護密切相關，還能抑制補體誘導的足細胞損傷、細胞衰老、細胞內的活性氧產生，降低p-p38蛋白表達。

臍帶MSCs與骨髓、臍血來源的MSCs相似，具有間充質干細胞特征。臍帶MSCs具有多向分化潛能，不表達或低表達移植相關的細胞表面標記，免疫原性低，使用不需經過嚴格配型，同種異體移植無免疫排斥反應或反應較弱，適宜于不同個體之間的移植。使它在組織工程、神經系統疾病、肝臟疾病、心血管系統疾病、免疫系統疾病、視網膜疾病、糖尿病、腫瘤疾病等方面具有巨大的優勢。

本實驗就Rg1對hUCMSCs增殖特性的影響進行了研究，CCK-8檢測結果顯示Rg1各劑量對hUCMSCs的增殖有明顯促進作用，而H2O2則明顯抑制hUCMSCs增殖，Rg1對H2O2抑制hUCMSCs增殖的效應有明顯逆轉作用，且H2O2可明顯抑制Rg1對hUCMSCs的促增殖效應。這一結果表明，Rg1對hUCMSCs增殖的作用明顯，H2O2也明顯抑制hUCMSCs的增殖，但Rg1可部分降低H2O2對hUCMSCs增殖的抑制作用。Rg1促進造血干祖細胞增殖的作用及本實驗中Rg1促進hUCMSCs增殖提示，Rg1在hUCMSCs促進神經細胞再生與功能恢復中有良好的輔助效果。

p38是MAPKs超家族的成員之一，在細胞分化信號通路、細胞衰老、應激反應和許多疾病的發生和發展中起著至關重要作用[14]。JNKs家族是MAPKs超家族的另一個成員，JNK和(或)p38的活化促使炎癥反應加重甚至細胞衰老[15,16]，與TNF-α炎性反應產生密切相關。此外，通過激活p38信號轉導途徑可以促進氧化應激的發生，誘導細胞衰老。p38 MAPK活化其下游通路可能導致干細胞周期停滯、衰老[17]。

本研究結果顯示，H2O2損傷的hUCMSCs中TNF-α的水平升高，推測這可能是H2O2損傷的hUCMSCs發生炎性反應所致。我們加入Rg1后對hUCMSCs進行檢測，結果發現，與模型組相比，Rg1各劑量組TNF-α、p-JNK和p-p38蛋白的表達降低，表明Rg1抑制H2O2損傷hUCMSCs導致的TNF-α、p-JNK和p-p38高活性，從而對H2O2損傷的hUCMSCs產生保護性作用，促進過氧化損傷的修復。

綜上所述，Rg1可使hUCMSCs增殖增加，衰老細胞百分比減少，TNF-α、p-JNK、p-p38表達降低，表明Rg1可以對H2O2損傷的hUCMSCs產生保護性作用，促進過氧化損傷的修復。