靈芝孢子粉多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)表征及免疫活性初探

馮蒙蒙，王海鳴，楊惠成， 孫 震， 孫秀蘭， 戴 軍*

（1.食品與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.廣州廣電計(jì)量檢測股份有限公司，廣東 廣州510065；3.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

靈芝是一種珍貴的藥用真菌，屬于擔(dān)子菌門擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬，又稱 “靈芝草”、“仙草”、“長生草”，在我國有悠久的藥用歷史[1]。傳統(tǒng)中醫(yī)視之為名貴滋補(bǔ)類藥材，有扶正固本、延年益壽之功效，是上等保健醫(yī)療佳品。靈芝孢子是靈芝生長成熟期從菌蓋彈射出來極其細(xì)小的種子，具有靈芝的全部遺傳活性物質(zhì)[2]。近年來藥理試驗(yàn)表明，靈芝孢子粉比靈芝子實(shí)體具有更強(qiáng)更全面的生理活性，是靈芝的精華部分，具有抑制腫瘤細(xì)胞生長，調(diào)節(jié)、提高人體免疫力，降低膽固醇，提高肌體耐缺氧能力等功能[3-5]；靈芝多糖類化合物是靈芝孢子粉或子實(shí)體及菌絲體中主要的活性成分之一[6]。

目前，市場上對靈芝子實(shí)體多糖的研究及開發(fā)利用已經(jīng)非常廣泛，從靈芝子實(shí)體中分離出來的多糖已有一百五十多種，其中大部分為β-型葡聚糖，少數(shù)為α-型葡聚糖[7]。另外，有文獻(xiàn)報(bào)道在已分離的靈芝子實(shí)體中具有β-（1→3）鍵連接的D-葡聚糖的活性較大[8]。然而，有關(guān)靈芝孢子粉的研究雖然已有近20年的時(shí)間，但關(guān)于從一種靈芝孢子粉中同時(shí)分離出多個(gè)多糖級分并對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征和免疫活性研究的報(bào)道較少[9]。本文作者針對東北吉林某企業(yè)培育的一新品種靈芝的孢子粉，采用水浴回流法提取粗多糖，并進(jìn)一步分離純化得到兩個(gè)多糖級分GLP1a和GLP1b，同時(shí)對這2個(gè)組分的基本結(jié)構(gòu)和免疫活性進(jìn)行初步的研究。本研究對了解和評價(jià)該品種靈芝孢子粉及其多糖的質(zhì)量和特點(diǎn)，進(jìn)而深入研究其多糖構(gòu)效關(guān)系及更好的開發(fā)利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

樣品：赤芝破壁孢子粉由吉林某企業(yè)提供；

試劑：苯酚、濃硫酸、三氯甲烷、正丁醇、三氟乙酸（TFA），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈，美國Tedia公司產(chǎn)品；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP），美國Acros Organics公司產(chǎn)品；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT），美國Biosharp公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)液，美國Gibco公司產(chǎn)品；

樹脂D101，河北滄州寶恩材料有限公司產(chǎn)品；DEAE Sepharose Fast Flow，美國GE Healthcare公司產(chǎn)品；Sepharose CL-6B，美國GE Healthcare公司產(chǎn)品；MD44-3.5透析袋，美國Viskase公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200高效液相色譜儀，配紫外檢測器，Agilent公司產(chǎn)品；Waters 1525高效液相色譜儀，配2414示差折光檢測器，Waters公司產(chǎn)品；Spectra Max M2多功能酶標(biāo)儀，美谷子儀器有限公司產(chǎn)品；氮吹儀，杭州奧盛儀器有限公司產(chǎn)品；BSZ-100自動(dòng)部分收集器、玻璃層析柱，上海滬西分析儀器廠有限公司產(chǎn)品。

1.3 孢子粉多糖的提取

稱取約20 g已破壁靈芝孢子粉樣品置于500 mL的平底燒瓶中，按料液比 1∶20（g/mL）加入 400 mL去離子水，搖勻，在100℃下水浴回流提取6 h，真空抽濾，水提液濃縮至適量，加入三倍體積無水乙醇在4℃下靜置過夜，8 000 r/min離心20 min，沉淀依次用95%乙醇和無水乙醇洗滌，離心后去上清，40℃真空干燥。

將粗多糖配成10 g/L的多糖溶液50 mL置于三角瓶中，加入3.0 g D101樹脂，于140 r/min、50℃下震蕩脫色4 h。脫色后的多糖溶液按體積比5∶1加入Sevag試劑，強(qiáng)烈震蕩20 min，靜置分層后除去白色絮狀物和氯仿相，重復(fù)此過程直到白色絮狀物不再出現(xiàn)。

1.4 多糖的分離純化

1.4.1 將1.3中脫色脫蛋白質(zhì)后的粗多糖配制成30 g/L左右的多糖溶液10 mL，經(jīng)過DEAE Sepharose Fast Flow 層析柱（2.6 cm×30 cm）進(jìn)行陰離子交換色譜分離，自動(dòng)部分收集器收集200管，1～100 管用 pH 7.8、0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液進(jìn)行洗脫，101～200 管用 0.01～1.0 mol/L NaCl-0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，流速為8 mL/min，1 min/管。通過苯酚硫酸法跟蹤檢測每一管的多糖含量，繪制洗脫曲線，合并相同級分，分別透析、濃縮及凍干。

1.4.2 將1.4.1獲取的多糖級分通過Sepharose CL-6B柱（2 cm×100 cm）進(jìn)行凝膠過濾色譜分離，洗脫液為 0.1 mol/L NaCl，流速 0.5 mL/min，10 min/管，共收集100管，采用苯酚硫酸法跟蹤檢測每一管的多糖含量，繪制洗脫曲線，合并相同級分，分別透析、濃縮及凍干。

1.5 HPSEC分析

1.5.1 色譜條件 Shodex OHpak SB-803、SB-804、805HQ 8.0 mmID×300 mmL三根柱串聯(lián)，檢測器為示差折光檢測器，以0.1 mol/L NaNO3溶液為洗脫液，流速為0.8 mL/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣體積為20 μL。

1.5.2 多糖樣品相對分子質(zhì)量分析及純度鑒定將相對分子質(zhì)量分別為 2.7×103、9.75×103、3.68×104、1.35×105、2.0×106的標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖配成約 3 g/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣分析，由GPC軟件自動(dòng)處理數(shù)據(jù)得到相對分子質(zhì)量校正曲線方程。然后，將多糖樣品配制成10 g/L的水溶液，0.22 μm微孔膜過濾，同樣條件下進(jìn)樣分析。

1.6 多糖級分的完全酸水解

多糖樣品的完全酸水解方法參照參考文獻(xiàn)[10]。

1.7 混合單糖標(biāo)樣及多糖級分的PMP衍生化

混合單糖標(biāo)樣和多糖樣品的衍生化方法參照參考文獻(xiàn)[11]。

1.8 HPLC分析條件

色譜柱為 ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm ID，5 μm），以 0.1 mol/L pH 6.7 磷酸鹽緩沖液-乙腈（體積比為83∶17）為流動(dòng)相，檢測波長為245 nm，柱溫為30℃，流速為 1.0 mL/min，進(jìn)樣體積為 20 μL。

1.9 紅外光譜分析

分別稱取多糖級分1 mg置于研缽中，加入適量溴化鉀充分研磨，壓片，400～4 000 cm-1的范圍內(nèi)掃描32次，分辨率為4 cm-1。

1.10 核磁共振分析

分別稱取約30 mg多糖樣品溶于D2O中，配置成飽和溶液，DSS做內(nèi)標(biāo)，VANCE III HD核磁共振儀，400 MHz，40℃條件下測1H NMR和13C NMR譜。

1.11 多糖樣品促進(jìn)正常小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)

2個(gè)多糖級分促進(jìn)正常小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)方法參照參考文獻(xiàn)[12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 孢子粉多糖的分離級分

按照1.4.1的方法，靈芝孢子粉粗多糖由DEAE Sepharose Fast Flow柱層析得到中性多糖GLP1和酸性多糖GLP2兩個(gè)級分，如圖1所示。2個(gè)級分的得率分別為：GLP1，78.54%；GLP2，6.49%。GLP1 和GLP2經(jīng)Sepharose CL-6B柱分離結(jié)果見圖2。由圖可知，經(jīng)Sepharose CL-6B柱分離后中性多糖GLP1得到3個(gè)組分GLP1a、GLP1b和GLP1c，酸性多糖GLP2得到2個(gè)組分GLP2a和GLP2b。本文著重對相對分子質(zhì)量較大的中性多糖級分GLP1a和GLP1b做進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)表征和免疫活性討論（關(guān)于GLP1c和GLP2a、GLP2b的分析研究另文發(fā)表）。

圖1 靈芝孢子粉多糖在DEAE Sepharose Fast Flow柱上的分離洗脫曲線Fig.1 Elution profile of Ganoderma lucidum polysaccharide by DEAE Sepharose Fast Flow

圖2 GLP1和GLP2在Sepharose CL-6B柱上的分離洗脫曲線Fig.2 Respectively elution profiles of GLP1 and GLP2

2.2 多糖級分的純度測定及相對分子質(zhì)量分布

HPSEC測得GLP1a和GLP1b的相對分子質(zhì)量分布色譜圖于圖3，由圖可見，2級分均為單一對稱峰，說明GLP1a和GLP1b皆為均一多糖組分。同時(shí)按照1.5方法，由HPSEC測得5個(gè)多糖級分的重均相對分子質(zhì)量（Mw）、數(shù)均相對分子質(zhì)量（Mn）及相對分子質(zhì)量分布寬度（Mw/Mn）如表1所示。

圖3 GLP1a和GLP1b的HPSEC圖Fig.3 HPSEC chromatogram of GLP1a and GLP1b

表1 5種多糖級分的相對分子質(zhì)量分布Table 1 Relative molecular mass distribution of five polysacc-haride fractions

2.3 單糖組成

12個(gè)單糖標(biāo)樣和2個(gè)多糖級分GLP1a、GLP1b的水解產(chǎn)物的PMP柱前衍生化反相高效液相色譜圖如圖4和圖5所示。根據(jù)12個(gè)單糖標(biāo)樣峰的保留時(shí)間對GLP1a、GLP1b進(jìn)行定性，由圖5可知，GLP1a和GLP1b主要由葡萄糖組成，其摩爾百分比分別為97.07%和95.96%，因此，GLP1a和GLP1b均為葡聚糖。

圖4 12種標(biāo)準(zhǔn)單糖經(jīng)PMP衍生化后RP-HPLC圖譜Fig.4 Chromatography of PMP derivatives of twelve kinds of monosaccharides by HPLC

圖5 GLP1a和GLP1b經(jīng)PMP衍生化后的RP-HPLC圖譜Fig.5 RP-HPLC chromatograms of GLP1a and GLP1b by PMP derivatives

2.4 紅外光譜分析

紅外光譜圖顯示，GLP1a和GLP1b的特征峰主要出現(xiàn)在 3 400，2 920，1 640，1 375 cm-1和 1 060 cm-1附近。其中3 400 cm-1附近較強(qiáng)、較寬的吸收峰是糖類的O-H伸縮振動(dòng)，2 920 cm-1附近的弱吸收峰是糖類C-H的伸縮振動(dòng)，這2組峰是糖類的特征吸收峰。1 640 cm-1附近的較強(qiáng)吸收峰是糖的C＝O伸縮振動(dòng)，1 375 cm-1附近的峰是表示C-H的變角振動(dòng)，1 000～1 200 cm-1附近寬吸收峰是吡喃環(huán)C-O-C和C-O的伸縮振動(dòng)吸收峰。另外，896 cm-1附近較小吸收峰是典型的吡喃葡聚糖和β-型糖苷鍵連接的特征吸收峰[13-15]。

圖6 GLP1a和GLP1b的紅外光譜Fig.6 FT-IR spectrum of GLP1a and GLP1b

2.5 核磁共振分析

如圖7和圖8所示，GLP1a的1H NMR譜和1C NMR譜的異頭區(qū)域都只有一個(gè)信號峰，說明只有一種β構(gòu)型的糖殘基組成；13C NMR譜信號峰分布在60～104 ppm區(qū)域之間，說明不含糖醛酸；δ82-84 ppm區(qū)域中無信號，說明為吡喃糖；異頭區(qū)域只顯示103.24 ppm一個(gè)信號，其連接碳的化學(xué)位移為70.19 ppm，說明GLP1a的主鏈為β-1，6-吡喃葡聚糖；其他峰信號均為未取代的碳信號[16-18]。

圖7 GLP1a的13H NMR譜圖Fig.7 13H NMR spectrum of GLP1a

由GLP1b的1H譜和13C譜圖（圖9和圖10）可知，GLP1b與GLP1a的結(jié)構(gòu)基本相似，但是GLP1b在δ85.41 ppm和δ79.47 ppm處各有一弱峰，分別為發(fā)生氧取代的C-3和C-4的信號，說明部分1→6連接的葡萄糖在3位和4位有分支。

圖8 GLP1a的13C NMR譜圖Fig.8 13C NMR spectrum of GLP1a

圖9 GLP1b的13H NMR譜圖Fig.9 13H NMR spectrum of GLP1b

圖10 GLP1b的13C NMR譜圖Fig.10 13C NMR spectrum of GLP1b

2.6 體外對正常小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖作用的影響

圖11 是上述2個(gè)相對分子質(zhì)量較大的中性多糖級分GLP1a和GLP1b對正常小鼠淋巴細(xì)胞增殖影響的初步試驗(yàn)結(jié)果，其結(jié)果顯示，多糖級分GLP1a和GLP1b對小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖均有一定的促進(jìn)作用，并且都有明顯的量效關(guān)系。GLP1b促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的效果明顯高于GLP1a，這可能與其相對分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)有關(guān)。

圖11 GLP1a和GLP1b對正常小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.11 Effect of GLP1a and GLP1b on the proliferation by splenic lymphocytes of normal mice

3 結(jié)語

從吉林某企業(yè)培育的一新品種靈芝的孢子粉中提取和分離得到5個(gè)多糖級分，其中2個(gè)中性多糖GLP1a和GLPb的重均相對分子質(zhì)量分別為1.12×106、1.21×105。 單糖組成、紅外、核磁共振的分析結(jié)果表明：GLP1a和GLPb均為葡聚糖，主鏈均以β-（1，6） 糖苷鍵連接，GLP1b在部分 1→6連接的葡萄糖的3位和4位有分支。MTT實(shí)驗(yàn)表明，2個(gè)多糖級分都能夠促進(jìn)正常小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖，并且都存在明顯的量效關(guān)系，但GLP1b的活性明顯高于GLP1a。類似GLP1b的孢子粉多糖的結(jié)構(gòu)分析曾有報(bào)道[19]，但類似GLP1b的孢子粉多糖的免疫活性和具有類似GLP1a的分子量及其糖苷鍵特征的葡聚糖在有關(guān)靈芝孢子粉多糖的研究文獻(xiàn)中尚未見報(bào)道。