生物抑菌劑對4種常見腐敗菌抑制效果

鄭瑞生，莊端寧， 楊 瑩，陳健偉，吳曉菲

（泉州師范學院 海洋與食品學院，福建 泉州 362002）

隨著食品安全意識的提高，民眾對食品的防腐保鮮問題越來越重視。據估計，全世界每年約有10%～20%的食品由于腐敗而廢棄，由此造成巨大的經濟損失[1]。應對食物防腐保鮮，人們第一反應是使用化學防腐劑，但過量添加化學防腐劑可致癌，而使用物理防腐的方法對食品的破壞性大。為此，開發出抗菌性強、安全無毒害的天然防腐劑已成為新的研究熱點[2]。

ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，簡稱 ε-PL）由單個賴氨酸分子在α-羧基和ε-氨基形成酰胺鍵而連接成的多聚體，有20～30個賴氨酸單體組成[3]。ε-PL抑菌譜廣、pH值范圍寬、安全性高，在高溫下穩定，水溶性強，在人體內可分解為人體必需的L-賴氨酸[4]。作為一種天然、營養、安全特性的防腐劑，ε-PL已被FDA批準為安全食品保鮮劑。乳酸鏈球菌素也稱乳酸鏈球菌肽或尼生素（簡稱Nisin），是世界公認的一種高效、無毒、安全的天然防腐劑，它是由牛乳和乳酪中自然存在的乳酸鏈球菌發酵而產生[5-7]。殼聚糖（chitosan，簡寫CTS）是甲殼素脫乙酰基后得到的產物，是自然界中唯一能夠大量存在的堿性氨基多糖，具有抑菌的廣譜性。正因為這種性質使得它作為一種天然的抗菌劑[8-10]。

本文中以ε-PL、Nisin、CTS 3種天然生物抑菌劑為材料，將食品中常見的腐敗菌枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和沙門氏菌（Salmonella）作為實驗菌，通過控制生物抑菌劑質量濃度、pH值以及與螯合劑（甘氨酸（Gly）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA））等復配進行抑菌效果研究，為獲得較為安全，天然的生物保鮮技術，減少食品中腐敗菌污染，延長食品保藏期提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌：均取自福建農林大學食品科學學院；營養瓊脂培養基、蛋白胨：杭州微生物有限公司產品；牛肉浸膏、NaCl、HCl、NaOH、乙酸、葡萄糖、檸檬酸、磷酸氫二鈉、Gly、EDTA、CTS，均購自國藥集團化學試劑有限公司產品。ε-PL：產自蘭州偉日生物工程有限公司產品；Nisin：產自浙江銀象生物工程有限公司產品。

1.2 儀器與設備

YJ-875型潔凈工作臺：蘇州三興凈化有限公司產品；UV-1200型紫外可見光光度計：上海美譜達儀器有限公司產品；DZF-6050型真空干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司產品；SPX-250B-Z型生化培養箱、BXM-30R壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業有限公司產品；JM-B30002型電子天平，德國賽多利斯集團產品；電子萬用爐：天津市泰斯特儀器有限公司產品；PHS-3C型pH計：上海雷磁儀器廠制造；SHA-B恒溫振蕩器：常州國華電器有限公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種的活化與培養 將枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌分別接種于營養肉湯培養基中，36℃搖床培養24 h，活化菌種。再用平板劃線法分離單菌落，挑取單菌落接種于營養肉湯培養基進行培養。

1.3.2 不同的生物抑菌劑對四種腐敗菌的最低抑菌濃度（MIC）的測定 含抑菌劑的液體培養基的配制：分別取1.0 g ε-PL溶解于200 mL無菌水中；取1.0 g Nisin溶解于50 mL 0.02 mol/L稀鹽酸中，再用無菌水定容至200 mL；取1.0 g CTS溶解于50 mL 0.2 mol/L乙酸中，用無菌水定容至200 mL，調節pH值至中性，將上述3種生物抑菌劑配制成5 g/L ε-PL、Nisin、CTS的母液。 接著用無菌水稀釋為：0、0.156 25、0.312 5、0.625、1.25、2.5、5.0 g/L。 分別取1 mL的稀釋液于4 mL的營養肉湯培養基中，混勻，配制成質量濃度分別為：0、0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0 g/L的含生物抑菌劑的液體培養基。

接種培養：分別接種經36℃恒溫搖床培養18～24 h的4種腐敗菌液0.1 mL于上述含不同質量濃度生物抑菌劑的培養基中，使接種后培養基中菌液的細胞濃度控制在1.0～5.0×104CFU/mL，在36℃條件下培養24 h后，取出菌液在600 nm波長比色，記錄數據。

1.3.3 不同生物抑菌劑對4種腐敗菌最小致死濃度（MLC）的測定 取1..2所述生物抑菌劑質量濃度為：0、0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L的帶菌液體培養基，取0.1 mL于固體平板培養基中，混勻，放入36℃的培養箱中培養24 h后，取出觀察記錄平板上的菌落數。

1.3.4 不同生物抑菌劑濃度對4種腐敗菌抑菌效果的測定 取經36℃恒溫搖床培養18～24 h的4種腐敗菌液，加到（55±5）℃的固體培養基中，菌液濃度控制在1.0～5.0×104CFU/mL，混勻倒入平皿，制成含菌平板。在平板上安放直徑為8 mm的牛津杯，分別加入 0.2 mL 質量濃度為 0、1、2、3、4、5 g/L 的ε-PL、Nisin、CTS溶液注入牛津杯。置于36℃培養箱中培養，待24 h后，取出并用游標卡尺測量抑菌圈的直徑，進行3次平行實驗。

1.3.5 不同pH值條件下生物抑菌劑對4種腐敗菌的抑菌效果的測定 用0.1 mol/L，pH為3.0～8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和0.1 mol/L，pH為9～10的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液分別配置濃度為3 g/L的 ε-PL（pH 為 4、6、7、8、10）、3 g/L 的 Nisin（pH 為3、4、5、6）溶液、3 g/L 的 CTS（pH 為 3、4、5、6）。 分別移取不同pH的生物抑菌液0.2 mL，按1.3.4的方法加入含菌平板的牛津杯中，置于36℃培養箱中培養，待24 h后，取出并用游標卡尺測量抑菌圈的直徑，進行3次平行實驗。

1.3.6 不同螯合劑與生物抑菌劑復配對4種腐敗菌抑菌效果的測定 將表1配置好的復合抑菌劑分組分別加入牛津杯中進行抑菌實驗，36℃培養24 h，取出并用游標卡尺測量抑菌圈的直徑，進行3次平行實驗。抑菌劑配方見表1。

表1 生物抑菌劑的螯合試驗Table 1 Chelating experiments of bio-inhibitor

1.3.7 數據分析與統計方法 采用DPS軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 生物抑菌劑對4種腐敗菌MIC、MLC的分析

生物抑菌劑對4種腐敗菌的MIC實驗結果見表2。

表2 不同生物抑菌劑的MICTable 2 MIC of different bio-inhibitors

由表2 可知，ε-PL、Nisin、CTS 對 4 種腐敗菌的生長均有顯著的抑制作用，并且抑制作用隨著生物抑菌劑質量濃度的增加而增大。ε-PL對4種腐敗菌的MIC均為0.125 g/L。Nisin對蠟樣芽孢桿菌的MIC為0.125 g/L，對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC均為0.25 g/L，對沙門氏菌MIC為0.5 g/L。除金黃色葡萄球菌MIC為0.25 g/L，CTS對其余3種腐敗菌的MIC均為0.5 g/L。

ε-PL對革蘭氏陽性、陰性菌均有較好抑菌效果，這是由于ε-PL是一種陽離子的聚合多肽，正電荷的存在有利于ε-PL與靶細胞表面上帶負電的位點相結合，阻止了細胞內外間物質的運輸，從而達到抑制細菌生長的效果[11]。Nisin中DHA和DHB能夠和某些對應敏感菌株細胞膜中的某些酶的巰基發生反應，進而造成敏感細胞裂解[12]。CTS對4種菌的抑菌效果相對較弱，其主要是依靠CTS的陽離子吸附帶有負電荷的細菌，讓細胞壁和細胞膜上負電荷的分布不均勻，導致細胞膜不能承受滲透壓的變化而變形破裂，引發細菌溶解死亡[16]。

表3 不同生物抑菌劑的MLCTable 3 MLC results of different bio-inhibitors

腐敗菌在平板上均無菌落生長，相應質量濃度作為其MLC。由表3可知，ε-PL對枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和沙門氏菌的MLC均為0.125 g/L，對金黃色葡萄球菌的MLC為0.25 g/L。Nisin對4種腐敗菌的MLC均為3 g/L。CTS對金黃色葡萄球菌的最小致死濃度為4.0 g/L，其余3種均為5 g/L。ε-PL表現出的良好的抑菌性，其次是Nisin，而相對CTS的抑菌效果最差。ε-PL具有多聚陽離子，能破壞微生物細胞膜的結構，引起微生物細胞內物質、能量和信息傳遞中斷，它還能與細胞內的核糖體結合從而影響生物大分子的合成，最終導致細胞裂解死亡[13]。

2.2 不同生物抑菌劑質量濃度對4種腐敗菌的抑菌效果

由圖1～4可知，在pH值相同條件下，隨著抑菌劑的質量濃度增大，對4種腐敗菌的抑菌效果也逐漸增強。ε-PL對4種腐敗菌的抑菌效果最為明顯，生長趨勢差異極顯著（P＜0.01）。Nisin其次，差異也達到顯著水平（P＜0.05）。CTS的抑菌效果相對較差，在質量濃度3～5 g/L時差異不顯著（P＞0.05）。可見，ε-PL對4種腐敗菌均能起到很好的抑制作用。這是因為ε-PL是一種靠肽鍵連接羧基與氨基基團的多聚L-賴氨酸，具有廣譜抗菌性，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌均有抑制作用。據研究，ε-PL可直接吸附到細胞膜上，最終導致細胞死亡，或者抑制細菌的呼吸作用，同時作用于細胞膜和蛋白合成系統，與核糖體結合抑制蛋白質和酶的合成，從而達到殺菌目的[14-15]。而Nisin是一種由乳酸乳球菌核糖體上合成的并經過一系列酶學修飾的以含有羊毛硫氨酸和β-甲基羊毛硫氨酸等稀有氨基酸為特征的抗菌肽，Nisin與細胞膜通過結合，插入和孔道形成等多步過程形成孔道復合物，從而引起細胞液滲漏。Nisin的抑菌效率取決于其分子結構，受目標控制菌及其系統性質的影響，如Nisin抗性、膜干擾劑、亞致死傷害、陽離子、溫度、pH、蛋白水解酶和其它防腐劑，能夠抑制許多引起食品腐敗的革蘭陽性菌[16]。而CTS的抑菌效果不穩定可能受其分子量和脫乙酰度的影響，隨分子量的變化表現出不規則的變化，且不同的分子量段有不同的變化趨勢，導致抑菌效果不盡相同。

圖1 不同生物抑菌劑對枯草芽孢桿菌的抑菌效果Fig.1 Antibacterial effects of different bio-inhibitors against Bacillus subtilis

圖2 不同生物抑菌劑對蠟樣芽孢桿菌的抑菌效果Fig.2 Antibacterial effects of different bio-inhibitors against Bacillus cereus

圖3 不同抑菌劑對金黃色葡萄球菌的抑菌效果Fig.3 Antibacterial effects of different bio-inhibitors against Staphylococcus aureus

圖4 不同生物抑菌劑對沙門氏菌的抑菌效果Fig.4 Antibacterial effects of different bio-inhibitors against Salmonella

2.3 不同pH值對4種腐敗菌的抑菌效果

由圖5～圖8可知，ε-PL對4種腐敗菌的抑菌圈大小隨著pH升高呈先上升后減少的趨勢，在中性條件下（pH=7）抑菌圈直徑最大，抑菌效果最好。而在酸性及堿性條件下，ε-PL的抑菌活性較差，差異達到顯著水平（P＜0.05）。這可能是由于聚賴氨酸作為賴氨酸的聚合物在酸性和堿性條件下易分解的緣故。Nisin和CTS在中性和堿性的情況下難溶，在酸性情況下溶解度較大，因此實驗的pH值控制在3～6。隨著pH值降低，Nisin和CTS對4種腐敗菌的抑制作用越好，Nisin和CTS在pH值3～4時抑制作用最好，但隨著pH值的增加，抑制作用逐漸減弱。據研究表明，酸性條件下Nisin的活性較強，其對原生質的作用方式會使細胞質基質的失活，導致細胞溶解，細胞質如三磷酸腺苷的滲出，最終導致細菌的死亡。而CTS是一種堿性聚合物電解質，pH值的變化對CTS有效抑菌基團的數量及其抑菌效果的發揮有重要影響。當pH值高于6時，CTS分子中的氨離子會被氫氧根所中和，使得其分子中的有效抑菌基團的數量下降，進而導致其抗菌效果降低；而當pH低于6時，CTS所帶的正電荷，會和帶負電荷的微生物細胞膜上的陰離子相結合，影響微生物細胞壁的發育和細胞膜質代謝，增大細胞膜的通透性，引起細胞內物質的外泄，從而干擾微生物細胞正常的生理功能，達到抑制細菌生長的目的[17]。

圖5 不同pH值對枯草芽孢桿菌的抑菌效果Fig.5 Antibacterial effects of different pH values on Bacillus subtilis

圖6 不同pH值對蠟樣芽孢桿菌的抑菌效果Fig.6 Antibacterial effects of different pH values on Bacillus cereus

圖7 不同pH值對金黃色葡萄球菌的抑菌效果Fig.7 Antibacterial effects of different pH values on Staphylococcus aureus

圖8 不同pH值對沙門氏菌的抑菌效果Fig.8 Antibacterial effects of different pH values on Salmonella

2.4 不同螯合劑與生物抑菌劑復配對4種腐敗菌的抑菌效果

由圖9～圖11 可知，單獨使用 ε-PL、Nisin、CTS對四種腐敗菌具有良好的抑菌效果，其中，尤以ε-PL的抑菌效果最佳。而單獨使用Gly基本無抑制作用。單獨使用EDTA，雖能對4種腐敗菌起到一定的抑制作用，但是抑制的效果不長，容易發生反復，即初期效果明顯，培養一段時間后細菌有恢復生長的現象。Gly與3種生物抑菌劑復配效果無明顯的變化，但產生的抑菌圈有更為清晰持久，表明Gly對3種生物抑菌劑有一定的增效作用。將3種生物抑菌劑和EDTA復合使用抗菌作用顯著增強，尤其以ε-PL最為顯著，ε-PL綜合了EDTA的抑制作用，可以增大抑菌圈范圍，起到良好的抑制作用。3種生物抑菌劑與Gly和EDTA復配也能起到良好的協同增效作用，但效果不如生物抑菌劑與EDTA復配明顯，表明EDTA的協同抗菌增效顯著。

圖9 螯合劑對聚賴氨酸抑菌效果影響Fig.9 Inhibitory effects of chelating agents with ε-PL

圖10 螯合劑對Nisin抑菌效果影響Fig.10 Inhibitory effects of chelating agents with Nisin

圖11 螯合劑對CTS抑菌效果影響Fig.11 Inhibitory effects of chelating agents with chitosan

3 結語

以食品中4種常見腐敗菌 （枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌）為實驗菌，研究ε-PL、Nisin、CTS在不同條件下對腐敗菌的抑制效果。結果如下：

ε-PL、Nisin、CTS均能對 4種腐敗菌的生長起到抑制作用，其中以ε-PL的效果最好，Nisin其次，CTS由于受溶解性及pH影響，抑菌效果不太理想。ε-PL對枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的MIC，均為0.125 g/L，MLC除沙門氏菌為0.2 g/L，其余均為0.125 g/L；Nisin對4種腐敗菌的 MIC分別為依次分別為 0.125、0.25、0.25、0.5 g/L；MLC 分別為 2.5、3.0、2.5、3.0 g/L。 CTS 對 4種菌的MIC除沙門氏菌為0.5 g/L外，其余均為0.25 g/L，MLC除金黃色葡萄球菌為4.0 g/L，其余均為5.0 g/L。ε-PL、Nisin對4種腐敗菌均有良好的抑菌效果，抑菌劑質量濃度1～5 g/L的范圍內，抑菌效果隨質量濃度的增大而增強；CTS的抑菌效果相對較差，在質量濃度3～5 g/L時對4種腐敗菌抑制效果差異不顯著（P＞0.05）。不同pH值對生物抑菌劑抑菌活性有著很大的影響。在pH值為7時，ε-PL對4種腐敗菌的抑制效果最佳，隨著酸性或堿性的增強，ε-PL的抑菌效果均有所下降。Nisin和CTS的抑菌效果隨pH的降低而升高，表明酸性條件能夠增強Nisin和CTS的抑菌能力。

3種生物抑菌劑與螯合劑復配的抑菌效果不盡相同：與Gly復配無明顯的協同增效作用，但能提高抑菌效果的持久性；與EDTA的復配對腐敗菌抑制具有較明顯的增效作用，尤其是ε-PL與EDTA復配抑菌效果顯著且穩定。