吡咯喹啉醌在抗腮腺輻射損傷的保護作用研究

黃元清 苗登順 陳寧

放射治療是頭頸部惡性腫瘤綜合治療中有效方法之一，但腮腺輻射損傷引起口腔干燥是頭頸部放射治療的主要和常見并發癥之一[1]，嚴重影響患者的生活質量。Wang等[2]證實小鼠非致死性劑量的全身輻射(total body irradiation, TBI)能誘導造血干細胞(hematopoietic stem cells, HSCs)中活性氧類(reactive oxygen species, ROS)水平的升高，導致HSCs成熟前早衰。因此放射防護的關鍵是抑制氧化應激清除過多的ROS防止DNA 損傷。

吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)首次在甲基營養菌中被鑒定為一種乙醇和葡萄糖脫氫酶的新型輔因子，目前被認為是一種重要的營養生長因子[3]。研究發現PQQ的化學結構為一種4,5-二羥基-4,5-二氧喹啉-2,7,9-三羧酸復合物[4]，被認為是細菌葡萄糖脫氫酶氧化還原的輔因子，廣泛分布于植物、細菌、動物、食物以及許多生物體液內[5]，具有水溶性和熱穩定性等特點。

前期研究已經證實[6]，PQQ作為抗氧化劑能部分糾正Bmi-1缺失誘導的頜骨和牙齒骨質疏松。表明PQQ可能通過清除氧自由基ROS，從而延緩機體骨質疏松。因此我們推測PQQ是否能夠通過抑制氧化應激，降低ROS水平保護線粒體功能，從而對TBI引起小鼠腮腺損傷具有保護作用？

本研究利用TBI引起小鼠腮腺損傷的動物模型，推測PQQ是否能夠通過抑制氧化應激，降低ROS水平，從而發揮對腮腺輻射損傷的保護作用。

1 材料與方法

本項研究經過了南京醫科大學動物實驗倫理委員會的批準(批準號： BK2006576)。

1.1 實驗動物

1.1.1 實驗動物 C57BL/6J小鼠(8 周齡)購買于南京大學動物實驗中心。小鼠飼養在南京醫科大學SPF級動物實驗中心，所有試驗程序均按照美國國立健康與倫理道德委員會以及關愛動物實驗中心的要求來進行。

1.1.2 實驗動物分組 將30 只雌性C57BL/6J 小鼠分成3 組，每組10 只將分別給予以下不同處理：對照組為普通飲食(含1%鈣、0.67%磷)飼養未經TBI處理；TBI組為4 Gy TBI加普通飲食(含1%鈣、0.67%磷)飼養；PQQ治療組為4 Gy TBI+4 mg PQQ/kg普通飼料的小鼠作為實驗組。

1.1.3 小鼠接受TBI的條件 小鼠置于有機玻璃盒內，加蓋有孔，固定小鼠，背上腹下，通過直線加速器(Varian 600CD，Faxitron Contact公司，德國)從蓋上小孔行單劑量全身輻射，輻射時間為10 min，輻射劑量參照Dirix等研究[7]以4 Gy劑量行小鼠TBI可導致腮腺細胞損傷。

1.1.4 PQQ飲食補充劑量為4 mg PQQ/kg普通飼料，依據參照課題組前期研究[6]PQQ對小鼠頜骨和牙齒骨質疏松影響的研究。

1.2 實驗方法

1.2.1 取材 經TBI后4 周，取3 組小鼠，斷頸處死。取右側腮腺使用能更好保存酶活性和組織抗原性的PLP(2%副醛，75 mol/L賴氨酸，10 mol/L過碘酸鈉) 固定液固定，經常規脫水、石蠟包埋、切片，用于HE染色、組織化學染色和免疫組化染色；取左側腮腺提取蛋白質用于Western blot分析；另取一組的同側腮腺進行流式細胞儀(BD Biosciences FACSCanto II,Becton, Dickinson and Co，美國)檢測ROS水平。

1.2.2 HE染色 石蠟切片常規脫蠟水化，蘇木精(Sigma，美國)染色，1%鹽酸酒精分化，流水沖洗返藍，伊紅(Sigma，美國)復染，常規脫水透明，中性樹膠封片。

1.2.3 免疫組織化學染色 取腮腺組織的石蠟切片進行固定、脫水、石蠟包埋切片，進行增殖細胞核抗原(PCNA)、8-hydroxy-2’-deoxyguanosine(8-OH-dG)免疫組織化學染色以及TUNEL染色。

1.2.4 Western blot 取左側腮腺組織提取的蛋白質，作Western blot分析，觀察細胞衰老相關蛋白表達的變化，檢測指標如下：SOD1、SOD2、P16、P19表達的變化。

1.2.5 流式細胞儀ROS水平檢測 用0.25%胰酶消化腮腺組織塊，制備單細胞懸液，加入ROS敏感的熒光探針2’,7’-二氯二氫熒光素二乙酯(DCF-DA)，流式儀檢測細胞內熒光探針平均熒光強度。

1.3 統計學方法

采用SPSS 11.0軟件對腮腺組織的計量資料3 組間的總體比較和兩兩比較分別進行單因素方差分析和t檢驗，以雙側P<0.05為差異有統計學意義。采用Image Pro Plus圖像處理與分析軟件分析組化染色圖像。

2 結 果

2.1 PQQ對TBI誘導的腮腺形態損傷的作用

與正常小鼠腮腺HE染色比較觀察發現：10 只經4 Gy TBI后第30天小鼠腮腺腺泡細胞排列出現紊亂，腺泡細胞萎縮、消失、導管擴張，可見脂肪空泡變性。而與4 Gy TBI組相比較，4 Gy TBI+PQQ組(圖 1)小鼠腮腺腺泡細胞增多，排列較規則，間質中脂肪空泡性變改善。這些數據表明PQQ對TBI誘導的C57BL/6J小鼠腮腺形態損傷具有糾正作用。

圖 1 PQQ對TBI誘導的腮腺損傷形態學的作用 (HE, ×400)

Fig 1 The effects of PQQ on the morphology of parotid glands induced by TBI (HE, ×400)

2.2 PQQ對TBI誘導小鼠腮腺間質纖維化的作用

Masson染色結果發現：4 Gy輻射組小鼠腮腺纖維化程度明顯高于未輻射組，然而，飲食補充PQQ明顯減少了間質纖維化面積(圖 2)，這些數據表明PQQ減少TBI小鼠腮腺間質纖維化的作用。

2.3 PQQ對TBI小鼠腮腺細胞增殖的影響

代表增殖細胞標志物PCNA的免疫組化學染色結果發現：TBI小鼠腮腺間質PCNA陽性細胞百分比明顯較未被輻射組小鼠減少。而PQQ具有明顯增加TBI小鼠腮腺間質PCNA陽性細胞百分比的作用(圖 3)。表明PQQ具有促進TBI小鼠腮腺細胞增殖的作用。

圖 2 PQQ 對小鼠腮腺間質纖維化的作用 (Masson染色, ×200)

Fig 2 The effects of PQQ on the stromal fibrosis of parotid glands (Masson staining, ×200)

圖 3 PQQ 對損傷腮腺細胞增殖的影響 (×400)

Fig 3 The effects of PQQ on the cell proliferation of damage parotid glands (×400)

2.4 PQQ對TBI小鼠腮腺細胞凋亡的影響

TUNEL染色結果發現TBI小鼠腮腺中表示凋亡的細胞TUNEL陽性細胞百分比明顯較未被輻射組小鼠增加。而PQQ具有明顯減少TBI小鼠腮腺細胞TUNAL陽性細胞百分比的作用(圖 4)。表明PQQ具有減少TBI小鼠腮腺細胞凋亡的作用。

圖 4 PQQ 對受損腮腺細胞凋亡的影響 (TUNEL 染色， ×400)

Fig 4 The effects of PQQ on the cell apoptosis of impaired parotid glands (TUNEL staining， ×400)

2.5 PQQ對TBI小鼠腮腺DNA損傷的影響

代表DNA損傷標志物8-OH-dG免疫組織化學染色結果發現：TBI小鼠腮腺細胞8-OH-dG陽性百分比明顯較未被輻射組小鼠增加。而PQQ具有明顯減少TBI小鼠腮腺細胞8-OH-dG陽性細胞百分比的作用(圖 5)。以上數據表明PQQ具有減少TBI小鼠腮腺細胞DNA損傷的作用。

2.6 Western blot

結果發現PQQ具有上調各種抗氧化蛋白的作用。且具有抑制各種細胞周期依賴性激酶抑制劑的作用(圖 6)，從而調節細胞周期，促進細胞增殖發揮對TBI小鼠腮腺損傷的保護作用。

圖 5 PQQ 對TBI誘導腮腺DNA損傷的修復作用 (×400)

Fig 5 The effects of PQQ on the DNA damage of parotid glands induced by TBI (×400)

圖 6 PQQ對輻射后腮腺抗氧化蛋白、細胞周期蛋白的調節作用

2.7 PQQ對受損腮腺組織ROS 水平的調節作用

為了驗證PQQ是否通過抑制氧化應激，降低ROS水平，從而對TBI小鼠腮腺起損傷保護作用，取小鼠腮腺進行流式細胞ROS的檢測，結果發現：TBI小鼠腮腺組織ROS 水平明顯較未被輻射組升高，而飲食補充PQQ確實具有降低ROS水平的作用(圖 7)。

圖 7 PQQ 對輻射后腮腺組織ROS水平的調節作用

3 討 論

動物實驗已經證明[8]，X-射線輻射能減少天然抗氧化劑維生素E的產生。在本研究中，我們利用全身輻射導致小鼠腮腺損傷動物模型，驗證PQQ作為抗氧化劑是否具有防止腮腺損傷的作用。結果證明飲食補充PQQ治療經TBI 后的C57BL/6J小鼠可明顯減少腮腺損傷。

研究表明，經TBI小鼠24 h內腮腺早期受損表現為唾液量減少以及腮腺重量減輕[9]。然而，在臨床上目前仍未找到一種合適藥物來治療輻射引起的腮腺損傷，因而研究者開始關注一種抑制或減少DNA損傷的輻射保護劑。這種輻射保護劑直接靶向減少電離輻射和活體組織中的氧自由基的形成[10]。作為一種強抗氧化劑，PQQ 可能具有清除氧自由基防止輻射引起腮腺分泌細胞損傷的作用[11-12]。

本研究發現飲食補充PQQ確實對受損腮腺具有保護作用。主要表現在：PQQ通過促進細胞增殖、抑制細胞凋亡和DNA損傷糾正了受損腮腺的形態結構，然而PQQ發揮作用的分子機制目前尚未清楚；進一步的研究表明PQQ不僅抑制細胞周期依賴性激酶抑制劑和凋亡基因，而且上調不同抗氧化蛋白；同時也證明了PQQ能減少受損腮腺的ROS 水平?？傊?，PQQ 作為抗氧化劑能夠抑制氧化應激減少ROS水平，同時通過下調p19, p16-Rb信號通路延緩細胞衰老。因而PQQ 對受損腮腺組織具有保護作用。

綜合以上實驗結果表明，PQQ對全身輻射誘導的C57BL/6J小鼠腮腺損傷具有保護作用；并進一步闡明PQQ可能通過上調抗氧化能力、抑制氧化應激、減少ROS水平參與DNA損傷修復作用，從而發揮對受損腮腺的輻射保護作用。為PQQ在輻射保護臨床新藥的研發提供一定的實驗和理論依據。