中田大山楂提取物對肝臟脂肪變性的保護作用分析

胡海杰，董青青，王秋彤，潘立文，張同存，羅學剛

(1. 工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2. 賀州學院，賀州 542800)

近年來，人類高血脂的發生率呈明顯上升的趨勢[1]．高血脂能夠誘發冠狀動脈粥樣硬化、心臟病和脂肪肝等，對人體健康危害極大．因此，預防和治療高血脂具有十分重要的臨床意義．山楂(Crataegus pinnatifida)是薔薇科植物，自古藥食兩用，具有健脾開胃、消食化滯等功效．現代藥理學研究證明，山楂具有預防和治療高血脂的作用[2–5]．在我國，山楂可以簡單地劃分為兩大類，即分布于華北地區的北山楂(俗稱山里紅)和分布于江浙、云貴、兩廣等地區的南山楂．目前，《中國藥典》中所列山楂主要是北山楂品種，包括 Crataegus pinnatifida和 Crataegus pinnatifida var．Major這兩類．近年來，隨著人們對山楂越來越多的關注，新品種山楂也隨之誕生，這些新品種山楂是否也具有與傳統山楂相近的功效，尚有待研究確證．其中，中田大山楂是賀州學院潘中田教授從南方野生山楂(Crataegus cuneata)中挑選、嫁接培育而出的一種南山楂新品種，具有果大、豐產、抗逆能力強等優點[6]．前期實驗已經證實中田大山楂也具有較好地降低高脂小鼠血清膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白等血脂指標的功效，并發現其對膽固醇的降低作用主要是通過阻斷 NF-κB核因子信號通路以抑制膽固醇合成限速酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGCR)的轉錄表達而發揮的[7]，然而其對脂肪酸代謝以及肝臟脂肪變性的影響作用尚未闡明．因此，本文利用前期動物實驗中所采集留存的組織樣本，通過病理切片、RT-PCR分析中田大山楂提取物對肝臟的保護作用及降血脂機理．此外，利用體外培養的肝細胞優化建立了高脂細胞模型，并利用該模型進一步對中田大山楂提取物的直接作用進行了分析驗證．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株

人肝癌細胞 HepG2細胞株為本實驗室保藏，在DMEM/HG培養基中加入體積分數為 10%,的胎牛血清，于37,℃、5%, CO2培養箱培養．

1.1.2 實驗動物

SPF級昆明種小鼠購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心(許可證號：SCXK-(軍)2012-0004)．

1.1.3 原料與試劑

中田大山楂為賀州學院潘立文教授惠贈，由本實驗室經過索氏提取法制備獲得提取物. DMEM/HG培養基，Gibco公司；胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司；M-MLV 逆轉錄酶、Trizol裂解液，上海英俊生物技術有限公司；隨機引物，上海生工生物工程有限公司；dNTP、T4,DNA 連接酶、油酸、DMSO、異丙醇，Solarbio公司．

1.2 方法

1.2.1 中田大山楂主要成分的分析

中田大山楂的主要成分由廣西壯族自治區分析測試研究中心根據國家相關標準進行分析測定．

1.2.2 中田大山楂提取物的制備

本實驗使用乙醇進行索氏提取法制備獲得提取物：取新鮮山楂果，洗凈、去核、切片(1～2,mm)，60,℃烘烤 24,h，粉碎過 80目篩，得山楂粉．山楂粉中加入 10倍量(g∶mL)的 95%,乙醇，提取 3次，每次 2.5,h，過濾，合并濾液．濾液 65,℃減壓蒸餾，得稀浸膏．加水至浸膏體積的兩倍，混勻，4,℃靜置 8,h，傾出上清液，沉淀部分過濾，棄掉濾液．取一定量的沉淀，加入 95%,的乙醇溶解，堿液調節 pH 8～9，產生大量沉淀，過濾，棄濾餅．取堿沉后的濾液，加入一定量的活性炭，回流30,min，放冷，過濾．取脫色后的濾液調節 pH 5～6，回收乙醇至盡，加入適量的水，4,℃靜置 4,h，過濾，沉淀于 40,℃減壓干燥，即得提取物．

1.2.3 高脂動物模型的建立

健康雄性昆明小鼠 60只，4周齡，(20±2)g，適應性飼養5,d后，隨機分為6組，每組10只，具體分組及飼喂方式見表 1．其中高脂飼料配方(質量分數)為：基礎飼料(市售常規小鼠飼料)78.8%,，蛋黃粉10%,，豬油 10%,，膽固醇 1%,，脫氧膽酸鹽 0.2%,．

飼養條件：溫度(22±2)℃，濕度 50%,～60%,，自由飲水、進食，其中受試樣品中田大山楂低、中、高劑量組以及陽性對照辛伐他汀組每日灌胃給予相應藥物，基礎組和高脂對照組則每日給予等體積的PBS．每 2～3,d更換 1次墊料，每日自然光照，實驗持續5周．

表1 實驗動物分組及飼養方式Tab. 1 Experimental grouping and feeding mode

1.2.4 逆轉錄PCR(RT-PCR)

利用Trizol提取法將從小鼠肝臟提取的RNA用M-MLV 逆轉錄方法進行逆轉錄[8]．RNA 2,μg、隨機引物 5,μL，70,℃水浴 5,min，迅速冰??；10,mol/L dNTPs 5,μL 、 5× buffer 5,μL 、RNAse 抑 制 劑0.625,μL、M-MLVRT 1,μL 混勻，37,℃反應 1,h；70,℃保持10,min終止反應．

取 1,μL 產物進行 RT-PCR擴增，以 GAPDH 作為內對照，擴增體系為 25,μL：雙蒸水 16.5,μL，10,mmol/L dNTP 2,μL，上、下游引物各 1,μL，100,μmol/L 10×PCR 緩沖液 2.5,μL，模板和酶各1,μL．PCR 條件：95,℃預變性 5,min；95,℃變性 30,s，共 28 個循環；54,℃退火 30,s，72,℃延伸 45,s；72,℃延伸10,min．引物序列見表2．

表2 RT-RCR引物序列Tab. 2 Primer sequence for RT-PCR

1.2.5 肝臟病理切片分析

將肝臟組織塊投入 10%,福爾馬林固定液中，再由體積分數 10%,～100%,乙醇作脫水劑，逐漸脫去組織塊中的水分．將組織塊置于透明劑二甲苯中，再置于已熔化的石蠟中，最后放入熔蠟箱保溫，待石蠟完全浸入組織塊后進行包埋．在切片機上切成很薄的切片，組織切片進行HE染色分析[9]．

1.2.6 高脂肝細胞模型的優化建立

以不加油酸的 HepG2細胞作為空白對照(Control)．用 1、2、3、4、5 μg/mL 的油酸對 HepG2 細胞誘導 48 h，5%,多聚甲醛固定 30 min，75%,乙醇洗滌 2次；油紅染色 30 min，75%,乙醇洗滌 2次；置于65,℃烘箱 10 min后，用 100%,異丙醇溶解油紅染色的細胞，在 600 nm 處測定吸光度，篩選出油酸最佳誘導質量濃度．此外，以最佳質量濃度的油酸分別對HepG2 細胞誘導 4、8、12、24、36、48、54 h，確定最佳誘導時間．

1.2.7 中田大山楂提取物對高脂細胞內油脂形成的影響作用分析

在確定了高脂肝細胞模型建立方法之后，進一步以 10、30、60 μg/mL 的中田大山楂提取物處理高脂細胞，通過油紅染色分析確定中田大山楂提取物對細胞內油脂含量的影響作用．

2 結果與分析

2.1 中田大山楂主要成分分析

對中田大山楂的主成分進行了分析檢測，結果見表 3．由表 3可知，中田大山楂含有豐富的維生素、氨基酸、微量元素、熊果酸、山楂酸、三萜類及黃酮類等活性物質．

表3 中田大山楂主要成分Tab. 3 Main components of Zhongtian hawthorn

2.2 中田大山楂提取物對高脂小鼠脂肪代謝關鍵酶的調控作用分析

脂肪細胞是機體合成及儲存脂肪的倉庫．當長期食用高熱量、高膽固醇食品時會引起肥胖，甚至造成肝臟病變[10–12]．脂肪酸轉運蛋白(fatty acid transport protein，FATP)是協調游離脂肪酸(free fatty acid，FFA)攝取、攜帶脂肪酸跨越細胞膜轉運的關鍵基因，激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive triglayceride lipase，HSL)、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACAC)則分別是脂肪分解和合成的限速酶[13-14]．

為了探索中田大山楂對脂肪代謝過程的調控機制，利用 RT-PCR與 qRT-PCR方法對飼喂中田大山楂提取物的高脂小鼠脂肪組織中 FATP、HSL、ACAC等的轉錄水平進行了分析，結果如圖 1所示．由圖 1可知，與正常對照組相比，高血脂組小鼠脂肪中FATP與ACAC均呈現出顯著的上調，陽性對照降血脂藥物辛伐他汀可抑制FATP與ACAC的轉錄表達，中田大山楂提取物可以明顯上調 FATP、下調 ACAC的表達．而對于HSL，與模型對照組相比，中田大山楂提取物各劑量組均體現出明顯的上調作用，其中高劑量組(130,mg/(kg·d))尤為突出，可使HSL 上調約1.6倍．這些結果說明中田大山楂可以通過抑制ACAC的轉錄表達，從而阻礙脂肪的生物合成．

圖1 中田大山楂提取物對高血脂小鼠脂肪代謝關鍵基因轉錄水平的影響Fig. 1 Effect of Zhongtian hawthorn extract on the transcription level of key genes associated with lipometabolism in hyperlipidemia mice

2.3 中田大山楂提取物對高血脂小鼠肝臟脂肪變性的保護作用

肝臟是身體內以代謝功能為主的器官，并在身體里面起著去氧化，儲存肝糖，分泌性蛋白質合成、產生膽汁等作用，而長期的高脂飲食則會導致肝細胞發生脂肪變性(即脂肪肝)，并逐漸演進為肝纖維化等癥狀[15–17]．本課題組在前期小鼠血脂實驗結果已證實[7]，中田大山楂提取物在給藥劑量為 50、90、130 mg/(kg·d)時可劑量依賴性地降低高脂小鼠血清膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白等血脂指標并抑制肥胖，然而其對肝臟脂肪變性的影響尚未確定．因此，在前期工作基礎上，本文進一步通過免疫組化對中田大山楂給予后高脂小鼠肝臟組織形態的變化情況進行了分析，結果如圖 2所示．與基礎飼料的正常對照組小鼠相比，高脂組小鼠的肝臟細胞形態紊亂，低劑量的中田大山楂提取物對小鼠肝臟保護作用不明顯，而中、高劑量則可與顯著緩解高脂飼喂所引起的小鼠肝臟病變．

圖2 中田大山楂提取物對高血脂小鼠肝臟脂肪變性的保護作用Fig. 2 Protective effect of Zhongtian hawthorn extract on the hepatic steatosis in hyperlipidemia mice

2.4 中田大山楂提取物對高脂肝細胞的直接影響作用分析

通過上述研究發現，中田大山楂提取物可抑制體內脂肪酸生物合成并對高血脂小鼠的肝臟病變具有很好的保護作用．但這種功效究竟是直接作用于肝細胞產生，還是在體內吸收、分布、代謝等一系列過程中間接產生的作用？為了明確這一點并進一步驗證中田大山楂提取物對肝細胞脂肪代謝及高脂化的保護作用，利用體外培養的 HepG2肝細胞構建了高脂細胞模型，并對其功能進行了分析驗證．

2.4.1 高脂肝細胞模型建立條件優化

首先，對油酸誘導高脂細胞模型的最佳條件進行了優化．用 1、2、3、4、5 μg/mL 油酸對 HepG2細胞誘導48 h后，經油紅染色后通過測定600 nm處的吸光度對細胞內油脂含量進行分析，結果如圖 3(a)所示，在采用 4 μg/mL油酸處理后，HepG2細胞內油脂含量達到最大．采用4 μg/mL油酸對HepG2細胞誘導最佳時間進行優化，結果如圖 3(b)所示，誘導 48 h效果后高脂模型的建立效果為最佳．

圖3 高脂肝細胞模型的建立條件優化Fig. 3 Optimization of the established high fat liver cell model

考慮到測定吸光度的方法對細胞內油脂的分析特異性及靈敏度均有所不足．進一步通過油紅染色方法對細胞內的脂肪情況進行了分析，結果如圖4所示．4 μg/mL油酸誘導48 h后(HF)，顯微鏡下觀察顯示 HepG2細胞中的油脂含量(圖中著色區域)顯著上升．而再次將油紅染色細胞用 100%,異丙醇溶解并測定600 nm處吸光度后，結果也顯示與對照組相比高脂誘導細胞中的油脂含量確有顯著增強(圖 4(b))，表明體外高脂肝細胞模型構建成功．

2.4.2 中田大山楂提取物對高脂肝細胞內油脂含量的影響

分別用 10,μg/mL(ZTL)、30,μg/mL(ZTM)、60μg/mL(ZTH)的中田大山楂提取物處理 HepG2高脂細胞，利用油紅染色檢測細胞內油脂含量變化情況，結果如圖 5所示．隨著中田大山楂提取物劑量的增加，HepG2高脂細胞內油脂含量顯著降低，表明中田大山楂提取物能夠劑量依賴性地抑制肝細胞脂肪合成過程．

圖4 高脂肝細胞模型中油脂含量的變化Fig. 4 Changes of the fat content in high-fat liver cell model

圖5 中田大山楂提取物對高脂肝細胞內油脂含量的影響Fig. 5 Effect of Zhongtian hawthorn extract on the fat content in high-fat liver cells

3 結 語

本文首先在動物水平上明確了中、高劑量中田大山楂提取物(90,mg/(kg·d)、130,mg/(kg·d))對高血脂小鼠體內脂肪生物合成的抑制作用以及對肝臟病變的保護作用．之后，建立并優化了高脂肝細胞模型，在細胞水平上通過油紅染色證實了60,μg/mL中田大山楂提取物可抑制肝細胞脂肪合成過程，為其相關功能食品及藥品的開發提供了基礎數據．此外，本文所優化確定的高脂肝細胞模型建立條件，對于降血脂活性物質的高通量篩選與評價也具有很好的實際應用價值．