基于生物胺和氨基酸的黃酒產地判別

李 妍，李 敏，朱曉娟，陳浩宇，呂曉玲，張 穎，張 健

(1. 食品營養與安全教育部重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457；2. 天津科技大學化工與材料學院，天津 300457；3. 天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

黃酒是我國特有的傳統酒種，與葡萄酒和啤酒并稱為世界三大古酒．黃酒是以谷物為原料，應用霉菌、酵母和細菌等多種微生物共同作用釀造而成，富含低聚糖、有機酸、氨基酸、維生素、微量芳香成分和礦物質等成分．黃酒營養豐富，在我國長江以南地區十分流行，深受消費者喜愛[1–2]．

黃酒產品的風格特點具有鮮明的地域性，比如：魯派黃酒以黍米為原料，酒液清亮透明，深棕紅色，酒香濃郁，口味醇厚，微苦而余香不絕；海派黃酒通過創新傳統黃酒的釀制工藝、配方，如添加枸杞、蜂蜜、姜汁，起到改變口感和增加營養雙重目的；閩派黃酒采用紅曲、糯米，配以山泉精釀而成，具有清爽、低糖、原味、本色、營養、綠色等特色；紹派黃酒以糯米為原料，采用鑒湖之水，按傳統工藝釀造，酒液橙黃清亮、醇厚甘甜、馥郁芬芳[3]．紹派黃酒是歷史最悠久、最有代表性的黃酒產品．2008年，紹興黃酒(紹興酒)成為我國第一個地理標志(原產地)保護的黃酒產品．按照標準 GB/T,17946—2008《地理標志產品·紹興酒(紹興黃酒)》[4]規定，只有使用紹興的鑒湖水系并嚴格按照紹興酒質量和工藝標準生產的黃酒，才能稱為“紹興黃酒”或“紹興酒”．隨著“地理標志”概念的推廣與普及，相信在不久的將來會有更多的特色黃酒產品受到原產地保護．

為了使標準能夠貫徹實施，黃酒的“地理標志”身份檢測至關重要．目前類似的檢測方法在葡萄酒、蜂蜜和中藥材中均有大量報道，但是對于黃酒產品，僅有寥寥幾篇采用電子舌、電子鼻或可見/近紅外光譜對黃酒進行風格、產地及酒齡的判別[5–7]．黃酒富含氨基酸，而氨基酸的種類和含量與原料和工藝息息相關．生物胺是由氨基酸脫羧而成，是黃酒中潛在的危害物質．氨基酸和生物胺基本代表了黃酒中主要的含氮物質，對這些成分的分析有可能找到不同產地黃酒中氮素的區別，從而對不同產地的黃酒進行判別區分[8]．

為此，本實驗以我國4個主要產地的黃酒為實驗樣本，通過高效液相色譜(HPLC)技術對其中的游離氨基酸和生物胺進行定性和定量分析．采用單因素方差分析 4個產區黃酒中的游離氨基酸和生物胺的差異，采用相關分析研究游離氨基酸和生物胺的相關性，最后采用多元統計方法分別建立基于游離氨基酸和生物胺水平的線性和非線性的產地判別模型，旨在為黃酒保真和原產地保護提供參考方法.

1 材料與方法

1.1 實驗原料

48個市售黃酒樣品來源于 4個產地(產地影響力較大，地域特征較強)，見表1．

1.2 試劑與儀器

衍生化試劑丹磺酰氯、2，4-二硝基氟苯、色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺，色譜純，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；氨基酸標準品(AAS18)、鳥氨酸、色氨酸，色譜純，Sigma公司；乙腈、甲酸，色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司；甲醇、丙酮、鹽酸(37%)、氨水(27%)、氫氧化鈉、碳酸氫鈉，磷酸二氫鉀、乙酸鈉，分析純，天津市江天化工技術有限責任公司．

表1 黃酒樣品的產地和數量Tab. 1 The origin and amount of rice wine samples

LC-20A型高效液相色譜儀，日本島津科技有限公司；ODS-C18色譜柱，天津博納艾杰爾科技有限公司；高速冷凍離心機，德國Thermo有限公司；渦旋振蕩儀，德國 Wiggens公司；超純水機，密理博中國有限公司；水浴鍋，天津歐諾儀器儀表有限公司；CNW MCX固相萃取柱，上海安譜實驗科技股份有限公司．

1.3 實驗方法

1.3.1 生物胺的測定方法

衍生化處理：吸取 1,mL生物胺混合標準溶液、1,mL衍生劑(丹磺酰氯溶液)、1,mL飽和碳酸氫鈉溶液于 10,mL離心管中，輕輕振蕩混勻，置于 60,℃恒溫水浴鍋中反應 30,min；衍生完成后取出冷卻，向離心管中加入100,μL氨水，再次置于60,℃水浴鍋中反應 15,min，樣液備用．將 CNW MCX固相萃取柱與Visiprep型固相萃取裝置相連，用甲醇和超純水洗柱后，將樣液與 5%,的甲酸混合后上柱，流速為 1～2滴/秒；待超純水淋洗萃取柱后，用含 5%,氨水的甲醇洗脫，收集洗脫后經0.22,μm有機膜過濾，待進樣．

色譜條件：色譜柱為 Phenomenon ODS-C18柱(250,mm×4.6,mm，5,μm)配以 C18 保護柱(4.0,mm×3.0,mm，5,μm)，采用二元梯度分析，流動相 A 為超純水，流動相 B 為 100%,乙腈，柱溫 30,℃，進樣量20,μL，流量 1,mL/min，檢測波長為 254,nm．

1.3.2 氨基酸測定方法

衍生化處理：取100,μL衍生緩沖溶液(碳酸氫鈉溶液)于10,mL EP管中，加入10,μL標準品或待測樣品和50,μL衍生劑，最后加入740,μL緩沖溶液(磷酸二氫鉀溶液)，避光65,℃水浴1,h．經0.22,μm有機膜過濾后，待進樣．

色譜條件：色譜柱為 Phenomenon ODS-C18柱(250,mm×4.6,mm，5,μm)配以C18 保護柱(4.0,mm×3.0,mm，5,μm)，采用二元梯度分析，流動相 A 為乙酸鈉溶液，流動相 B為乙腈/超純水(體積比為 1∶1)，柱溫 33,℃，進樣量 20,μL，流量 1,mL/min，檢測波長為360,nm．

1.4 統計分析方法

實驗數據的單因素方差分析(ANOVA)、相關性分析(CA)、主成分分析(PCA)、判別分析(DA)研究由 SPSS 17.0 實現(SPSS Inc.，Chicago，Illinois，USA)；由 MATLAB 7.14(Release 2012a，Mathworks，USA)進行人工神經網絡(ANN)分析．*表示 P＜0.05為顯著性差異，**表示 P＜0.01為極顯著性差異，均有統計學意義．

2 結果與分析

2.1 生物胺含量分析

2.1.1 生物胺混合標準品及樣品的液相色譜分析

標準品及樣品高效液相色譜圖如圖 1所示．從圖 1可以看出，各色譜峰間分離度良好，峰形尖銳，無拖尾現象，可以滿足常規的定性與定量分析．

圖1 生物胺混合標準品及樣品高效液相色譜圖Fig. 1 HPLC of the biogenic amine standards and the samples

2.1.2 生物胺含量概況

48個黃酒樣品中檢測出了 6種生物胺，色胺在所有樣品中均未檢出．浙江產地的黃酒中生物胺含量最高，其次為上海(表2)．

表2 生物胺的方差分析結果Tab. 2 ANOVA results of biogenic amines

2.2 氨基酸含量分析

2.2.1 氨基酸混合標準品及樣品的液相色譜分析

氨基酸標準品與樣品高效液相色譜圖見圖 2．由圖 2可以看出，各色譜峰間分離度良好，峰形尖銳，可以滿足常規的定性與定量分析．

2.2.2 游離氨基酸含量概況

48個黃酒樣品中檢測出了18種氨基酸，氯化銨和色氨酸在所有樣品中均未檢出．浙江黃酒中氨基酸含量最高，其次為上海(表3)．

2.3 多元統計分析

2.3.1 單因素方差分析

浙江、上海、山東和湖北產地的 48個黃酒樣品中，可檢出游離氨基酸及生物胺含量的單因素方差分析結果見表2和表3．結果表明，在95%,的顯著水平上，黃酒樣品中除甘氨酸、β-苯乙胺和尸胺外，其他21個變量在產地間均存在顯著差異．這可能與不同產區黃酒所用的原、輔料和工藝不同有關，呈現出很強的地域差別．總體而言，浙江產地黃酒中游離氨基酸(除甘氨酸)含量要明顯高于其他 3個產地．相應的，浙江產地黃酒中生物胺(除亞精胺)含量也明顯高于其他3個產地．

圖2 氨基酸標準品與樣品高效液相色譜圖Fig. 2 HPLC of the amino acids standards and the samples

表3 游離氨基酸的方差分析結果Tab. 3 ANOVA results of free amino acids

2.3.2 相關性分析

使用 Pearson’s積差相關度對用于產地鑒別的原始數據進行相關分析，表 4列出了顯著相關的60對變量，其中47對變量極顯著相關．由此表可以看出，腐胺、組胺、酪胺與大多數氨基酸之間密切正相關，而亞精胺與氨基酸之間呈負相關．由表 2—表 4可知：氨基酸含量越高，則生物胺含量也越高，浙江產區黃酒樣品中氨基酸含量豐富，所以生物胺含量也相對較高，上海次之；對于亞精胺而言，氨基酸含量越高，亞精胺含量越低，結果顯示浙江產區黃酒中亞精胺含量較其他3個產地的更低．

表4 變量間的Pearson’s顯著相關Tab. 4 Significant Pearson’s correlations between variables

2.3.3 逐步判別分析

判別分析中指標較多時，一些不重要變量的引入會產生干擾而影響判別效果，甚至一些變量的引入可能引起計算上的困難．因此，變量的選擇是判別分析中重要的問題，逐步判別分析就是解決合理選擇變量進行判別分析的一種方法．采用逐步判別的分析方法，從具有顯著差別的 21個變量中選出了 9個具有較強判別能力的變量：絲氨酸、賴氨酸、酪氨酸、丙氨酸、纈氨酸、酪氨酸、胱氨酸、組氨酸和組胺，進行 Fisher判別分析(典則判別分析)．得到 3個典則判別方程(函數 1、函數 2和函數 3)，各變量的系數見表5．

表5 產地鑒別典則判別方程系數Tab. 5 Canonical discrimination function coefficients of origin identification

本研究所用的逐步判別方法為Milks Lambra．其判據是：進入模型的F值為3.84；從模型中剔除變量的F值為2.71．生物胺變量中只有組胺進入了模型，可見在黃酒產地判別中，氨基酸更為重要．圖 3是 3個典則判別方程的三維得分圖，在圖中可清楚地看到48個樣品分布到 4個區域中，明顯可以分開．但是，對浙江產區內的地理標志紹興酒和紹興產其他黃酒及省內其他黃酒樣品，三維得分圖卻無法分開．

圖3 黃酒樣本的判別方程三維得分圖Fig. 3 3D scores of rice wine samples

用所建立的模型進行回代檢驗和交叉驗證(隨機從一組測定數據中抽取一部分數據來建立模型，用其余的數據檢驗此模型的驗證方法)，最終的 Bayes判別結果見表 6．回代檢驗結果表明，整體的判別正確率為 100%．交叉驗證中有 2個樣品的產地被判錯，整體判別正確率為 96%，誤判率較低．浙江產區中有1個樣品被誤判為上海的產品，但該樣品卻是地理標志紹興酒，可見采用逐步判別方法選擇氨基酸和生物胺對黃酒產地進行判別是可行的；但該方法無法對同屬浙江省的地理標志紹興酒和紹興產其他黃酒及省內其他黃酒樣品的進行判別．

表6 產地鑒別的Bayes判別結果Tab. 6 Bayes discrimination results of origin identification

地理標志紹興酒的認證必須具備3個條件：一是企業所屬地域必須在紹興鑒湖水系特定的地域范圍內；二是必須采用優質糯米、小麥、鑒湖水作為釀酒原料，經獨特工藝發酵釀造而成，產品質量必須符合國家標準 GB/T,17946—2008[4]；三是企業必須具有一定的人文歷史．由此可見，難于判別地理標志紹興酒和紹興產其他黃酒及浙江省內其他黃酒樣品是很正常和容易理解的．

黃酒中的氨基酸和生物胺受到原輔料、微生物、水質和釀造工藝等多種因素的影響，其差異間接反映了這些因素的不同．上海、山東、湖北產區的釀造用水均非鑒湖水，湖北產區的很多黃酒采用小曲糖化發酵，山東產區的很多黃酒采用黍米釀造．另外，釀造工藝上各產區也有自身的特點，有用傳統攤飯發酵，也有喂飯發酵；有大缸發酵人工開耙，也有大罐發酵自動開耙．總之，這些因素差別越大，以氨基酸和生物胺為參數分類酒樣就越容易．

2.3.4 人工神經網絡

人工神經網絡是一種模仿動物神經網絡行為特征，進行分布式并行信息處理的算法數學模型．這種網絡依靠系統的復雜程度，通過調整內部大量節點之間相互連接的關系，從而達到處理信息的目的，并具有自學習和自適應的能力[9]．BP網絡(back propagation)是目前應用最廣泛的神經網絡模型之一．BP網絡能學習和存貯大量輸入-輸出模式的映射關系，它具有實現任何復雜非線性映射的功能，能以任意精度逼近任何非線性連續函數．在建模過程中的許多問題正是具有高度的非線性，這使得它特別適合于求解內部機制復雜的問題[10]．

(1)隱含層神經元數的確定

隱含層神經元個數對 BP神經網絡影響較大，若隱含層神經元的個數較少，則不能充分描述輸出和輸入變量之間的關系；相反，若隱含層神經元個數較多，則會導致網絡學習時間變長，甚至會出現過擬合的問題．一般根據參考公式n =，其中 n代表隱含層神經元數，a代表輸入向量維數，b代表輸出向量維數，c代表 1～10的正整數，可推出隱含層單元數的選取范圍．根據上述公式可得出最佳隱含層神經元數在 5～15之間，依次從最小神經元數至最大神經元數訓練網絡(此時學習率為 0.01)，結果見表 7.由表7可知神經元數為7時決定系數R2相對較?。?/p>

表7 BP人工神經網絡中神經元個數的選取Tab. 7 Selection of neuron number in BP artificial neural network

(2)學習率的確定

學習率的確定大多根據經驗值進行多次嘗試，本實驗分別取 0.01、0.03、0.05，對網絡進行訓練和測試．推測在隱含層神經元數取 7時，網絡性能得到極大地改善．由表 8可知，學習率越大，網絡訓練次數越少，實際誤差變化較小．本實驗中擬選學習率為0.05．

BP神經網絡預測值與真實值對比如圖 4所示．從圖 4中可以清晰地看到，BP神經網絡能較好地實現產地的預測，模型擬合度良好，結果正確率100%，相對誤差低于 0.2%．人工神經網絡具有自學習功能和聯想存儲功能，在尋找一個復雜問題的優化解時，往往需要很大的計算量，利用一個針對某問題而設計的反饋型人工神經網絡，發揮計算機的高速運算能力，能很快找到優化解．相比逐步判別分析，人工神經網絡建模預測更準確；但顯然，該方法也無法對同屬浙江省的地理標志紹興酒和紹興產其他黃酒及省內其他黃酒樣品進行預測．

表8 BP人工神經網絡學習率的選擇Tab. 8 Selection of learning rate in BP artificial neural network

圖4 預測值與真實值對比Fig. 4 Contrast of predicted and real values

3 結 論

所有黃酒樣品中均未檢出色胺、氯化銨和色氨酸．不同產地的黃酒中，除甘氨酸、β-苯乙胺和尸胺外，其他 6種生物胺和 15種氨基酸均存在顯著差異．腐胺、組胺、酪胺與大多數氨基酸之間呈正相關，而亞精胺與氨基酸之間呈負相關．基于氨基酸和生物胺的含量的逐步判別方程和人工神經網絡模型均能實現黃酒產地的判別與預測，但是這兩種方法均無法對同屬浙江省的地理標志紹興酒和紹興產其他黃酒及省內其他黃酒樣品進行判別．

建立地理標志紹興酒的檢測方法對原產地保護具有重要意義，但難度很大，尤其是對于浙江省內采用鑒湖水系的釀造黃酒的地域，因為這些地域內很多酒廠的工藝相似、風土相近，地理標志紹興酒與非地理標志酒的區別也許并非黃酒本身，而在于是否認證．以不同產區(省)為單位來分類判別黃酒可能更為實際，這也是黃酒原產地保護的趨勢．