黃芩苷對復發性流產小鼠模型母胎免疫微環境的調節

馬雁南，楊小頎，馬曉軍，胥 冰，劉 洋

（1.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫藥大學第二臨床醫學院，陜西 咸陽 712046；3.陜西中醫藥大學第二附屬醫院生殖科，陜西 咸陽 712046；4.中國人民解放軍32144部隊，陜西 渭南 714000）

復發性流產（RSA） 其發病率約占妊娠女性總數的1%～5%[1]，其高發率嚴重影響育齡女性生殖健康及家庭和諧。黃芩具有清熱安胎的作用[2-4]，其主要成分之一黃芩苷的安胎效果已被證實[5-7]，但其是否通過母胎界面免疫微環境調節發揮作用，進而有效制約RSA的發生，鮮見報道。本實驗選用復發性流產小鼠模型[8-10]，在黃芩苷干預下經ELISA測試方法分別檢測子宮組織中4種細胞因子：IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10及孕酮含量變化情況，并對受孕小鼠子宮組織切片HE染色分析，旨在研究黃芩苷是否及如何通過調節子宮局部母-胎界面免疫狀態來發揮安胎作用，進而制約流產的發生，從免疫學角度來探討黃芩苷的安胎機理，為黃芩“清熱安胎”理論提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試劑及藥品 黃芩苷（Baicalin），購于博奧生物醫藥科技有限公司；蛋白酶抑制劑（Aprotinin），Biosharp產品。小鼠INF-γ、IL-2、IL-4、IL-10、孕酮ELISA測試盒，BioSource產品。

1.1.2 儀器設備 臺式高速冷凍離心機（Neofuge 13R），上海力申科學儀器有限公司。直立式超低溫冰箱（MDF-382E），SANYO Electric Biomedical Co.Ltd，Janpan。酶標儀（318MC），上海三科儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗組別處理 1）模型處理：8周齡SFP級CBA/J雌鼠30只，體質量20～22 g，DBA/2雄鼠10只，BALB/C雄鼠5只，由上海西普爾必凱實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK（滬）2013-0016。常規飼養，自由采食飲水，每日光照時間12 h。經觀察臨床健康，適應環境1周后，雌雄鼠交換墊料，1～2 d后肉眼觀察結合陰道涂片法檢查雌鼠發情情況。若陰道外觀紅潤或腫脹，開口較大，則初步判斷為發情期，行陰道涂片檢查確認。將發情的CBA/J雌鼠，與DBA/2雄鼠按2:1比例合籠交配，制造復發性流產模型；與BALB/C雄鼠按2:1比例合籠，制造正常妊娠模型。次晨檢出陰栓者，記為孕0 d。2）藥物配制：①黃芩苷液：黃芩苷10 mg，d2H2O 4 mL，配制濃度2.5 mg/mL。②苦味酸飽和水溶液：苦味酸1.5 g +蒸餾水100 mL。③Bouin’s：苦味酸飽和水溶液75 mL +甲醛25 mL。④蛋白酶抑制劑工作液：蛋白酶抑制劑2 mg溶解于甲醇 13.33 mL，得工作濃度 0.15 μg/μL。⑤ PBS：KCL 0.2 g + Na2HPO4.12H2O 1.44 g + KH2PO40.24 g，加蒸餾水800 mL溶解，調pH值7.4，定容至1 000 mL。3）模型分組：實驗動物分為正常妊娠組（A組：CBA/J雌鼠與BALB/C雄鼠交配）和實驗組（CBA/J雌鼠與DBA/2雄鼠交配制造的復發性流產模型），實驗組隨機分為模型對照組（B組）和黃芩苷治療組（C組），每組10只。A組自孕1 d開始連續灌胃磷酸鹽緩沖液0.4 mL/（d·只），共14 d。B組均自孕1 d開始連續灌胃磷酸鹽緩沖液0.4 mL/（d·只），共14 d；C組自孕1 d開始連續灌胃，黃芩苷0.4 mL/（d·只），共14 d。藥物劑量參考常用最佳量為實驗藥物劑量[11-12]。孕14 d處死所有孕鼠。4）實驗取樣：孕滿14 d頸椎脫臼法處死孕鼠。打開腹腔，暴露子宮，觀察子宮生長情況，記錄胚胎著床數目和胚胎吸收數目。發育正常的子宮胚胎形狀似串珠，色澤光鮮，大小均一，胚胎的中間部位可見紅色條索狀胎盤。而發育異常子宮呈黑紫或褐色，內可見陳舊性出血或伴血凝塊，體積明顯變小，部分胚胎萎縮或消失，解剖鏡下觀察，模糊一片無正常胚胎結構。而后在冰盒上完整取出子宮，除去系膜及脂肪組織后稱重。縱向剖開子宮，完整剝離胚胎后稱量子宮凈重。剪下右側子宮，稱重后加入pH = 7.4的磷酸鹽緩沖液（內含6倍量0.75 μg/mg的蛋白酶抑制劑），立即在低溫環境中進行勻漿，4 ℃，12 000 r/min，離心15 min。取上清液分裝，- 80 ℃凍存，用于ELSIA測定INF-γ、IL-2、IL-4、IL-10的含量。左側子宮剪下后立即放入Bouin’s液中固定，然后浸入70%乙醇中，用于HE染色。

1.2.2 測定各組別相關研究因素含量 遵照試劑盒說明書操作，反應終止后，在酶標儀450 nm波長處讀取吸光度（OD）值，利用已知濃度的標準樣品OD繪制標準曲線，據此標準曲線計算IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10細胞因子及孕酮的含量，并在電子顯微鏡下觀察各組別子宮組織切片HE染色差異。

1.3 統計學方法 所有數據使用Excel 2 000和SPSS 13.0軟件包進行統計，單變量方差分析組間差異顯著性。實驗數據以均數±標準差（x± s）表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組流產率、胚胎吸收率比較 見表1。

表1 各組妊娠率、胚胎吸收率比較（n = 10） %

2.2 各組子宮組織中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10細胞因子含量比較

2.2.1 子宮組織中Th1型細胞分泌細胞免疫因子IFN-γ、IL-2含量比較 見表2。

2.2.2 子宮組織中Th2型細胞分泌細胞免疫因子IL-4、IL-10含量比較 見表3。

2.3 各組子宮組織中孕酮含量比較 B組中P4的含量與A組相比差異顯著（P＜0.05）。C組中P4的含量與A組相比差異不明顯（P＞0.05）。C組與B組相比差異顯著（P＜0.05），見表4。

表2 子宮組織中Th1型細胞分泌細胞免疫因子IFN-γ、IL-2 的含量比較（x± s ，n = 10） pg/mL

表3 子宮組織中Th2型細胞分泌細胞免疫因子IL-4、IL-10含量比較（x± s ，n = 10） pg/mL

表4 各組子宮組織中孕酮的含量比較（x± s ，n = 10） pg/mL

2.4 各組子宮大體組織及切片HE染色分析 3組子宮胚胎大體標本結果：A組子宮胚胎形狀似串珠，色澤光鮮，大小均一，胚胎的中間部位可見紅色條索狀胎盤；B組子宮內可見陳舊性出血或伴血凝塊，體積明顯變小，部分胚胎萎縮或消失；C組子宮色澤紅潤，大小一致，胚胎發育正常。

3組HE染色結果：A組子宮腺體清晰可見，子宮蛻膜細胞排列整齊，大小均勻，數量正常；B組蛻膜細胞碎裂，數量明顯減少，大量炎細胞浸潤，局部難以見子宮腺體；C組蛻膜細胞明顯增多，排列整齊，核增大，腺體清晰可見。3組切片HE染色表現出明顯懸殊。

3 討論

復發性流產（RSA）是婦科一種常見且多發的疾病，其高發生率和高危害性已嚴重影響育齡女性生殖生育健康，被社會廣泛關注[11-13]。劉志蘭等[14]對臨床1 101例復發性流產病例研究分析后認為，RSA經典四大明確病因中，影響力從高到低依次為自身免疫異常（17.80%）、夫妻染色體異常（7.63%）、內分泌異常（5.36%）及解剖異常（3.73%）。隨著現代臨床檢測手段的不斷升級和生殖免疫研究的精準化深入，位列首位的致使RSA發生的自身免疫因素正逐步向母胎界面免疫微環境的耐受調節機制研究方面聚焦，因生理性妊娠過程依賴于母胎間免疫耐受的建立與維持，即母體免疫系統對胚胎遺傳的父系抗原所產生的反應是免疫支持和防護而非攻擊，而一旦這種保護性免疫機制失調，勢必導致流產等現象發生。研究[15-16]證實，若母胎界面免疫微環境中攻擊型Th1細胞分泌細胞免疫因子明顯強于防護型Th2細胞，即打破經典Th1/Th2平衡理論，則致使胚胎丟失，亦即發生流產行為。相關研究[17]表明，如缺乏IL-4，則無Th2型反應，其流產率及胚胎吸收率也驟然上升，可見子宮局部母-胎界面免疫狀態穩定對RSA的重要意義。

從本實驗統計結果可發現：在黃芩苷干預治療作用下，復發性流產小鼠模型的流產率及胚胎吸收率明顯降低，安胎效果幾乎與正常妊娠模型相似，充分證明黃芩苷可有效制約復發性流產的發生；同時，經ELSIA法測定受孕子宮勻漿組織中INF-γ、IL-2及IL-4、IL-10 4種免疫因子含量可見：黃芩苷作用下既明顯抑制Th1型細胞分泌INF-γ、IL-2因子，又明顯促進Th2型細胞分泌IL-4、IL-10因子，使得母胎界面免疫微環境的Th2型細胞因子的整體水平上調，促使Th1/Th2平衡偏向Th2型，抑制RSA發生，有力證明了黃芩苷通過調節子宮局部母-胎界面免疫狀態這一機制來制約復發性流產行為；另外，黃芩苷也明顯提升了子宮局部孕酮的含量水平，影響并保護蛻膜細胞及子宮腺體正常發育，為安胎提供了確鑿科學依據。

本文通過科學實驗不僅證明黃芩苷通過調節子宮局部母-胎界面免疫狀態機制，抑制Th1型免疫細胞，促進Th2型途徑發揮良好安胎作用，并能提升孕酮激素水平，有效降低RSA發生率，實驗成果較明顯。相信在進一步加強臨床結合基礎研究的將來，黃芩苷在治療復發性流產中必會有更大突破性進展。