膈下逐瘀湯加減方對氣滯血瘀型輸卵管炎大鼠模型TNF-α蛋白表達的影響

李 月，陳 培，劉 麗

（黑龍江中醫(yī)藥大學，哈爾濱 150040）

目前，不孕癥的發(fā)生率在我國為7%～10% 。而不孕原因中盆腔因素則占35%，其中以慢性輸卵管炎導致的不孕癥較為常見[1]。在治療方法上西醫(yī)則用抗生素、輸卵管通液術、宮腔鏡、腹腔鏡等治療，存在易反復發(fā)作，且創(chuàng)傷性較大等不良反應；而中醫(yī)藥治療則毒副作用較小，創(chuàng)傷性較小并且能有效減輕臨床癥狀。近年來，在臨床上應用膈下逐瘀湯加減方治療氣滯血瘀型輸卵管炎取得了較好療效。本研究應用雌性大鼠建立氣滯血瘀型輸卵管炎性模型，在造模成功后第29天同時分組給予膈下逐瘀加減方和康婦炎膠囊治療比較其對TNF-α蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8～12 周齡健康性成熟雌性 Wistar

大鼠48只，體質量平均為200 g ，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物合格證編號：SCXK（京）

2016-0001。標準環(huán)境（室溫19～24 ℃），標準大鼠飼料喂養(yǎng)，自由飲水，予以每日早8: 00到晚8: 00人工燈光照明。大鼠飼養(yǎng)房每日1次紫外線燈消毒 。

1.1.2 試驗藥品與試劑 膈下逐瘀顆粒藥物組成：牡丹皮15 g，赤芍20 g，延胡索 20 g，桃仁 15 g，鱉甲15 g，烏藥15 g，川芎15 g，香附20 g，枳殼15 g，地龍15 g（由黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院藥劑科提供）。康婦炎膠囊，山東步長神州制藥有限公司，批號：150530。

1.1.3 實驗菌種 4 × 109金黃色葡萄球菌懸液0.1 mL，菌號為 FSCC223005；10%水合氯醛，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20160709。

1.1.4 實驗儀器 TNF-α試劑盒（購自武漢博士德生物工程有限公司）；JTC-1 型驚覺及痛覺實驗交流刺激儀（成都儀器廠）；UC4-75 電鈴（白云電子器材廠）。

1.2 方法 經適應性喂養(yǎng)7 d后，將48 只Wistar雌性大鼠隨機分為4組，每組12只，分別為正常組、模型組（氣滯血瘀型輸卵管炎組）、成藥組（康婦炎膠囊組）、中藥組（膈下逐瘀湯加減方組）。造模前用電子稱稱重，隨即編號，正常對照組予以正常喂養(yǎng)，連續(xù)4周；模型組10%水合氯醛按0.4 mL/100 g經腹腔注射麻醉后，將大鼠臥式平放，兩側脊柱術區(qū)剃毛，然后碘伏消毒，取肋緣過腎區(qū)0.5 mL近脊柱側旁開 1 cm 行橫切口。打開腹腔，撥開其他組織，暴露輸卵管，然后將4 × 109金黃色葡萄球菌懸液 0.1 mL 注射到輸卵管后，逐層縫合肌層、皮層。手術完畢后再次進行皮膚消毒，然后另一側輸卵管同樣方法操作，術畢放于鼠籠內，等待蘇醒之后給予正常飼養(yǎng)，共 4周；1周給予聲光電刺激：比如大鼠足底 24～35 V 電擊刺激，噪聲刺激（等級為3級），頻率為 1～3 kHz 強度的閃爍光刺激，以上刺激每8～15 min 1次；夾尾：用長鑷夾大鼠鼠尾，使其與其他大鼠撕打（撕打時可松開鑷子），1次/h，傾斜鼠籠2 h，1次/d[2]，連續(xù)3周；造模后第29天開始灌胃給藥，成藥組為康婦炎膠囊懸液0.064 g/kg，灌胃體積為1 mL/100 g，連續(xù)灌胃28 d，中藥組為膈下逐瘀湯加減方0.064 g/kg，灌胃體積為1 mL/100 g，連續(xù)灌胃28 d。

1.3 測定指標

1.3.1 大鼠行為及宏觀體征觀察 觀察造模期間和造模后各組大鼠的活動情況、精神狀態(tài)、皮毛、色澤、舌質、大小便和飲食情況等。

1.3.2 血清TNF-α水平測定 于第29天，術前做好相關準備，每組隨機選取10只大鼠，水合氯醛（10%，3 mL/kg）麻醉大鼠后，分離腹主動脈，經腹主動脈取血后，取輸卵管用于TNF-α蛋白表達測定。依照ELISA 試劑盒操作規(guī)程測定 TNF-α蛋白水平。

1.3.3 組織病理學觀察 進行輸卵管標本的采集，肉眼觀察組織形態(tài)變化后，在10%中性甲醛溶液中固定，常規(guī)切片染色后，觀察輸卵管有無病理改變及改變程度的輕重。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，多組間比較用方差分析，計數資料比較使用χ2檢驗，等級資料分析用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠行為及宏觀體征變化比較 模型組與正常組相比，模型組大鼠出現爪、尾、舌從紅到紫的轉變、活動量減少、精神異常、呼吸減少、攻擊性增強、進食減少、糞便不成形、體質量增長緩慢等現象。

2.2 各組大鼠組織病理學變化比較 模型組與正常組相比輸卵管有病理改變及改變程度不同：模型組出現血管壁充血腫脹，管壁增厚，變硬，管腔阻塞不通，管體增粗，輸卵管常與卵巢黏連，輸卵管的傘端部分有部分或者完全的阻塞，閉鎖，黏膜皺襞向內卷曲，管腔與盆腔黏連程度重。

2.3 各組大鼠血清 TNF-α水平變化比較 與正常組相比較，模型組TNF-α蛋白表達強度差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，中藥組和成藥組TNF-α表達強度有顯著差異，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。同成藥組比較，中藥組TNF-α表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。膈下逐瘀湯加減方抑制輸卵管上皮TNF-α蛋白表達強度優(yōu)于成藥康婦炎膠囊。見表1。

表1 各組大鼠血清TNF-α水平變化比較（n = 6）

3 討論

由于社會醫(yī)療保障體系及法律保障體系的缺失，臨床試驗機構和臨床試驗的申辦方淪為臨床試驗中的弱勢群體。如若能做好相關病證結合的動物模型，即可在動物身上做實驗，然后應用于臨床，既能促進該疾病的進一步研究，同時也能保障臨床試驗機購的相關權益[3]。故為進一步探討氣滯血瘀型輸卵管炎的作用機制，可應用大鼠造出氣滯血瘀型輸卵管炎模型，雖然靈長類動物基因組與人類相似度較高，但其價格昂貴，物種稀有，實驗周期長，飼養(yǎng)條件高，故靈長類動物模型的使用受到限制，所以使用大鼠作為實驗對象[4]，即用金黃色葡萄球菌注射到輸卵管后造成輸卵管炎癥模型[5]，慢性輸卵管炎性模型成功后再此基礎上進行聲、光、電、夾尾的刺激，大鼠長期情志不舒，氣機不暢，無力推動血行，日久發(fā)展為血瘀，遂建成氣滯血瘀的模型[6]。輸卵管炎癥模型的成功建立再結合氣滯血瘀的模型，建立與證候相一致的動物模型。這種病證結合造模的方法，既在西醫(yī)病理造模的基礎上疊加中醫(yī)證候[7]。病證結合模型既有西醫(yī)明確的指標評價支持，又引入中醫(yī)的辨證思想。這更符合臨床診治的情況，更有利于探討疾病的病理變化在中醫(yī)特定證型中的表現，同時也方便用于西醫(yī)評價標準進行評估。從而可以更好的研究疾病的發(fā)病機制并找到有效的治療方法。輸卵管炎性不孕，歸屬于中醫(yī)學婦人腹痛、不孕、斷緒等病證范疇。主要病機為瘀血阻滯，脈絡不通，臨床以氣滯血瘀型多見，治療上多重視理氣活血，化瘀止痛[8-10]。膈下逐瘀湯出自清代王清任《醫(yī)林改錯》，主治血瘀引起的一系列病證[11]。近年來隨著對該方劑的不斷研究，發(fā)現其在輸卵管炎性治療方面有著顯著療效。如王忠[12]用膈下逐瘀湯治療輸卵管不通患者12例，總有效率80.0 %；趙麗燕[13]用輸卵管通液術聯合膈下逐瘀沖劑治療并與單純輸卵管通液術相比較，前者療效顯著。現代藥理學研究證明，方中赤芍、牡丹皮、桃仁，烏藥、川芎、枳殼、香附，鱉甲、地龍等，具有改善末梢循環(huán)的作用，使局部血供改善，有利于黏連組織的消散與吸收。本實驗結果表明，膈下逐瘀湯加減方能抑制輸卵管上皮TNF-α蛋白的表達，強度優(yōu)于成藥康婦炎膠囊。TNF-α是炎癥反應程度的重要指標，主要由單核細胞和巨噬細胞產生，在正常輸卵管以及炎性輸卵管黏膜上皮細胞上均有表達[14]，具有抗腫瘤機制、免疫調節(jié)作用，在炎癥反應的調節(jié)中起著重要作用，同時觀察發(fā)現大鼠腹腔黏連的程度越重，TNF-α的值會升高，而TNF-α產生減少，機體清除生殖道病原體的能力降低。如武孟香等[15]采用免疫組化法也發(fā)現 在正常輸卵管和炎癥輸卵管上均有TNF-α表達，但正常輸卵管黏膜上皮細胞的表達較低，炎癥輸卵管黏膜上皮細胞的表達顯著高于正常輸卵管組織。從而證明膈下逐瘀湯加減方通過對TNF-α的調節(jié)參與炎癥的愈合過程的結論，為輸卵管炎性不孕的發(fā)病機制與治療提供了理論依據。