正交試驗法優選生津片水提取工藝

馮 青，朱 凱，張燚曼，呂宏亮，于智莘

（長春中醫藥大學，長春 130117）

口干癥是一種以口干為主的多因素主觀癥狀，是由于大小涎腺減少分泌從而唾液減少所致。主要癥狀為口腔干燥，舌部燒灼感、味覺異常，口唇干裂、表面覆蓋痂皮等[1-3]，屬中醫“燥證”范疇，證候表現以內燥為主。中醫認為，口干之“燥證”，多由于陰津不足或陰虛內熱，口舌失于濡養而致，故治宜滋陰清熱，生津止渴[4]。生津片處方由黨參、麥冬、山豆根、天花粉、生地黃、射干、甘草組成，其功能為滋陰清熱，生津止渴，主治口干癥。生津片中水提成分甘草，為豆科植物甘草（Hyperglycemia urinalysis）、脹果甘草（Glycyrrhiza inf l ate Bat.）和光果甘草（Glycyrrhia glabra L.）的干燥根及根莖。味甘，性平，可入脾經、胃經、肺經，具有補脾益氣、清熱解毒、潤肺止咳、緩急止痛的功效[5-7]。現代藥理學研究[8]發現，甘草中的有效成分為三萜皂苷類、黃酮類和多糖類物質。本文以甘草中的甘草酸銨為考察指標，采用正交試驗法優選出生津片的水提工藝。

1 試藥與儀器

1.1 試藥 試驗藥材均購于吉林大藥房，經鑒定檢驗均符合《中華人民共和國藥典：1部》（2015 年）[7]有關規定；甘草酸銨標準品（中國食品藥品檢定研究院）；乙腈（色譜純）；磷酸（分析純）；無水乙醇（分析純）；異丙醇（分析純）；甲醇（分析純）；氨水（分析純）；三氯甲烷（分析純）。

1.2 儀器 萬分之一電子天平FA1004B（上海佑科儀器儀表有限公司）；電熱恒溫鼓風式干燥箱DHG-9070A型（上海精宏實驗設備有限公司）；電熱恒溫水浴鍋HHS（上海博訊實業有限公司）；超聲波清洗器KQ-500E（昆山市超聲儀器有限公司）；高效液相色譜儀LC-2030（上海市安亭電子儀器廠）；循環水真空泵SHZ-D（Ⅲ）（上海亞榮生化儀器廠）。

2 方法與結果

2.1 水煎組正交試驗設計 采用L9（34）正交試驗法對黨參、天花粉、麥冬、生地黃、甘草5 味藥材水煎液提取工藝進行考察優選。考察煎煮時間（A）、煎煮次數（B）、加水量（C）對甘草中甘草酸銨提取率的影響，每個因素選擇3個水平進行試驗[9-11]。因素水平表，見表1。

表1 因素水平表

2.2 高效液相法測定甘草酸銨含量

2.2.1 色譜條件 色譜柱：十八烷基鍵合硅膠為填充劑（inertsil ODS-3 C18色譜柱 4.6 mm×250 mm），固定相：十八烷基，粒度（μm）：5，表面積（m2/q）：450，孔徑（A）：100，碳含量；15%，封尾。流動相：乙腈- 0.05%磷酸（40:60）[12]，檢測波長：237 nm，流速：1 mL/min，柱溫：室溫[13]，理論板數：按甘草酸銨峰計算不低于5 000。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱定甘草酸銨對照品，加70%乙醇制成每1 mL含甘草酸銨0.2 mg的對照品溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱定0.2 g的供試品，置具塞錐形瓶中，精密量取70%乙醇100 mL，密塞，稱重，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放至室溫，再稱重，減失重量用70%乙醇補足，混合均勻，微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.2.4 標準曲線的繪制 精密稱取甘草酸銨對照品1 mg，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取系列對照品溶液2、4、6、8、10、12 mL置于25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，制成甘草酸銨系列對照品溶液，注入液相色譜儀，進行線性關系考察，結果見表2，并繪制標準曲線，見圖1。得回歸方程：Y = 5E+06 X - 1 177.8，r = 0.999 9，說明甘草酸銨在1.008 2～6.012 6 mg/mL范圍內呈良好的線性關系。

表2 線性關系考察

圖1 甘草酸銨標準曲線圖

2.2.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL，連續進樣6次，依法測定，記錄峰面積積分值。RSD為0.13%，表明儀器、方法的精密度良好。

2.2.6 穩定性考察 精密稱定0.203 7 g的1號供試品，置具塞錐形瓶中，按供試品制備方法進行處理，每隔一定時間注入液相色譜儀，結果表明，甘草酸銨峰面積RSD為1.06%，表明供試品在20 h之內有良好的穩定性。

2.2.7 重現性考察 精密稱取0.2 g供試品，稱取6份，按供試品溶液制備方法處理，計算RSD為0.28%，平均含量為2.497 6 mg/g，表明該方法重現性良好。

2.2.8 加樣回收率考察 精密稱取0.2 g同法測定的已知含量（C = 2.497 6 mg/g）樣品，平行稱定6份，分別置于錐形瓶中，各精密加入1 mg的甘草酸銨標準品。結果表明，RSD為1.39%，回收率良好。

2.3 生津片水提取最佳工藝確定 取水提取部分藥材80 g，共9份，按正交表設計進行試驗，考察指標：以甘草酸銨含量作為考察指標，試驗結果見表3，方差分析及結果，見表4。

表3 正交試驗L9 （34）及結果

表4 方差分析及結果

表3、表4結果方差分析顯示，影響因素對試驗結果的重要性依次為煎煮次數B＞煎煮時間A＞加水量C，綜合正交試驗結果，A3B3C2含量最高。而煎煮時間3 h與2 h沒有較大影響，結合生產實際情況及實驗操作，確定最佳工藝條件為A2B3C2。

3 小結

筆者認為，對中藥復方化學成分的研究，能夠從本質上闡明其藥效的物質基礎，從而揭示中藥方劑配伍的科學內涵[14-16]，并在處方優化、建立科學制劑和工藝改造等方面發揮重要的作用，從而有助于提高制劑質量、發現新的有效藥物[17-18]。

本實驗采用高效液相法測定甘草中甘草酸銨的含量，分離效果良好，操作簡便，實驗結果可信度較高，為優選生津片水提取工藝提供了有力的依據。最終確定生津片水提部分的提取工藝為加8倍量水，煎煮3次，每次1.5 h。工藝科學、合理，適用于大工業生產。