人參Cu/Zn SOD原核可溶性表達條件的優化

高云鵬，趙 雨，王思明，劉美辰，王佳雯

（長春中醫藥大學中醫藥與生物工程研究開發中心，長春 130117）

目前，多個物種的Cu/Zn SOD已經被克隆出來，并在大腸桿菌、酵母、煙草和昆蟲細胞等系統中得到了表達[1-11]。人參SOD廣泛應用于多個領域，尤其是化妝品行業。人參Cu/Zn SOD基因已經被發現并且在大腸桿菌中完成了表達，但是大部分蛋白是以包涵體形式存在的，給純化帶來了一定的困難[12]。本次研究通過優化誘導條件和誘導成分，獲得了可溶性表達的人參SOD蛋白，表達率略高于文獻，可溶性表達可以是純化過程簡化，省略了變性復性過程，保持蛋白天然構象和活性，未純化的粗酶即有SOD的活性，為大規模生產人參SOD重組蛋白及研究人參SOD生物學功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 原核表達載體pET-30α、pMD18T-pgSOD質粒由本實驗室保存。 E.coli DH5α菌株、E.coli BL21菌株購自碧云天公司，保存于- 80 ℃。限制性內切酶、DNA連接酶、膠回收試劑盒及質粒提取試劑盒等購自TaKaRa公司；

1.1.2 試劑 IPTG購自Sigma；SOD檢測試劑盒購自南京建成；其他生化試劑均為國產分析純或進口分裝試劑。

1.1.3 儀器 離心機（eppendorf centrifuge 5804R-德國），全自動蛋白質分離純化系統（AKTA start，美國），蛋白電泳儀（Power Pac-美國），搖床（IKA.KI4000-美國）。1.1.4 培養基 蛋白胨（OXOID-英國），酵母粉（OXOID-英國）。

1.2 pET-30α-pgSOD的構建和鑒定 pMD18T-pgSOD質粒和pET-30α經Not I和Nco I雙酶切后膠回收，在16 ℃連接過夜。轉化感受態DH5α細胞，接種卡那抗性的LB固體培養基，37 ℃條件下過夜培養，挑取單克隆，提取質粒后進行酶切鑒定。

1.3 重組人參SOD蛋白的誘導表達 測序正確的pET30α-pgSOD質粒轉化感受態BL21細胞，接種卡那抗性的LB固體培養基，37 ℃條件下過夜培養，挑取單克隆，培養過夜后，按照1:100比例轉接于100 mL培養基在37 ℃條件下擴大培養，待OD值達到0.6～0.8時，加入1 mmol/L IPTG及1.2 mmol/L CuSO4，0.25 mmol/L ZuSO4進行誘導，37 ℃條件下培養6 h。培養基在4 000 r/min條件下離心30 min，菌體使用20 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0）重懸，冰浴條件下超聲5 s，停5 s，共30 min。8 000 r/min離心30 min，獲得破碎上清。

1.4 重組人參SOD蛋白誘導條件的優化

1.4.1 誘導溫度對蛋白質可溶表達的影響 參考1.3項下，其余條件不變，誘導劑加入后于37、30、25 ℃繼續培養，完成誘導后收集菌體，超聲破碎后分別取上清和沉淀，通過SDS-PAGE分析蛋白質表達情況。

1.4.2 加入IPTG濃度對蛋白質可溶表達的影響 參考1.3項下，其他條件不變，OD值達到0.6～0.8時，分別加入0.5、1、1.5 mmol/L IPTG，誘導后收集菌體，超聲破碎后分別取上清和沉淀，SDS-PAGE分析蛋白質表達情況。

1.4.3 誘導時間對蛋白質可溶表達的影響 參考1.3項下，其他條件不變，加入誘導劑后分別培養6、12、18、24 h，收集菌體，超聲破碎后分別取上清和沉淀，SDS-PAGE分析蛋白質表達情況。

1.4.4 不同離子濃度對蛋白質可溶表達及酶活的影響 參考1.3項下，其他條件不變，誘導時分別加0、0.5、1.2、3 mmol/L CuSO4溶液，誘導后收集菌體，超聲破碎后分別取上清和沉淀，SDS-PAGE分析蛋白質表達情況。參考1.3項下，其他條件不變，誘導時加0、0.03、0.1、0.25 mmol/L ZnSO4溶液，誘導后收集菌體，超聲破碎后分別取上清和沉淀，SDS-PAGE分析蛋白質表達情況。

1.4.5 離子加入時機對蛋白質可溶表達及酶活的影響 參考1.3項下，其余條件不變，分別在培養基中，IPTG誘導時加入Cu2+和Zn2+，并設置不加離子的對照組，比較各條件下上清中的SOD活力差異。

1.5 SOD活力的鑒定 采用黃嘌呤氧化酶法測定目的蛋白的活力，按照試劑盒說明書完成實驗，活力計算公式：總SOD活力（U/mg）=（對照OD值-測定

OD值）/對照OD值÷ 50%×反應液總體積（mL）/取樣量（mL）÷待測樣本蛋白濃度（mg/mL）。

2 結果

2.1 原核表達載體 PET-30α-pgSOD雙酶切鑒定pMD 18T-pgSOD質粒和PET-30α雙酶切后連接過夜，重組質粒經Not I和Nco I雙酶切鑒定，在5 000 - 7 000 bp和500 bp兩處可見特異性條帶，提示目的片段成功插入到PET-30a載體中。

2.2 重組人參SOD蛋白的可溶性表達 通過SDSPAGE分析結果，與誘導前相比，誘導后的轉化菌在20～26 kDa處有明顯的特異性蛋白條帶，大小與理論值相符，應該為SOD蛋白。其中部分目的蛋白以可溶形式表達，部分在包涵體中。

2.2.1 誘導溫度優化 根據對不同誘導溫度下蛋白表達情況的比較，結果表明，25 ℃時目的蛋白表達量最高，且可溶性最好。

2.2.2 IPTG濃度優化 IPTG作為目的蛋白誘導劑，濃度過低不利于成功誘導，濃度過高會對菌體生長有抑制作用。通過對IPTG最佳誘導濃度的摸索，結果當終濃度為0.5 mmol/L時，目的蛋白上清中表達量最大。

2.2.3 誘導時間優化 根據對不同誘導時間下蛋白表達情況的比較，在誘導6 h時，上清中目的蛋白已經得到了較好的表達，沉淀中目的蛋白較少，隨著誘導時間的延長，雖然目的蛋白總量增加，但上清中的目的蛋白量沒有變化甚至減少，增加的表達量均在沉淀中。到誘導24 h時，雜蛋白的量提高，絕大部分目的蛋白均以包涵體形式表達在沉淀中。因此6 h為最佳誘導時間。

2.2.4 離子濃度優化 由于人參Cu/Zn SOD需要結合金屬離子才能發揮歧化酶作用，同時在金屬離子存在的情況下能夠提高蛋白折疊的正確率，增加蛋白可溶性。然而，金屬離子也具有一定的毒性，添加過多會導致菌體生長減慢甚至死亡，因此需要摸索Cu2+、Zn2+離子的添加濃度，結果當Cu2+和Zn2+的離子濃度為0.5 mmol/L 和0.1 mmol/L時，蛋白的可溶性最好，并且較少影響菌體生長。

2.2.5 離子加入時機優化 金屬離子的添加方式對酶活也具有一定影響，在誘導的同時加入Cu/Zn離子，所表達的蛋白酶活達到最高，達到363.9 U/mL，在培養基中加入離子也能提高酶活，為339.9 U/mL，超過不添加金屬離子的試驗組，139.6 U/mL。見表1。

表1 離子加入時機優化表

3 小結

本研究采用pET30a原核表達載體進行人參SOD的重組表達，pET系統在大腸桿菌中表達水平最高，調控最為嚴謹，表達周期短，能快速獲得結果，保證人參SOD的高效表達。重組蛋白的大腸桿菌中高水平表達時經常導致蛋白聚集，形成不可溶的，無活性的包涵體，為了解決這一問題，筆者參照文獻[13]，采用在誘導時加入金屬離子，提高蛋白表達后折疊的正確率，以可溶的有活性的形式表達出來。同時，通過對誘導時間、誘導溫度和最佳誘導劑濃度的摸索，使目的蛋白達到了最高表達量，成功優化了誘導條件。

本研究構建了人參Cu/Zn SOD原核表達載體，通過一系列條件優化，成功實現了人參SOD的可溶性表達，表達量高，上清活力約為363.9 U/mL。為人參SOD的純化及今后大規模生產和工業化應用奠定了基礎。