qPCR揭示丙酸降解菌群隨OLR提高的演替規律

張立國,李彥霖,班巧英*,李建政

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qPCR揭示丙酸降解菌群隨OLR提高的演替規律

張立國1,李彥霖1,班巧英1*,李建政2

(1.山西大學環境與資源學院,山西 太原 030006；2.哈爾濱工業大學市政與環境工程學院,黑龍江 哈爾濱 150090)

為探討有機負荷率(OLR)對升流式厭氧污泥床(UASB)反應器運行效能的影響及互營丙酸降解菌群的響應,以稀釋的制糖廢水為底物,考察了OLR升高對UASB處理效能的影響,并采用實時熒光定量PCR技術(qPCR)分析了互營丙酸降解菌群隨OLR提高的演替規律.結果表明,在OLR為6.0~54.0kgCOD/(m3·d)的范圍內,UASB處理制糖廢水取得了良好的效果,其COD去除率為92.0%以上.qPCR檢測結果表明,至少有3種已鑒定的丙酸氧化菌(,和)存在于UASB反應器中.其中,是主要的丙酸氧化菌,其數量為126~1.2×10316S rRNA 基因拷貝數/ng DNA,約占檢測到丙酸氧化菌總數的47.9%~58.6%. OLR從6.0提高至54.0kgCOD/(m3·d)導致所有丙酸氧化菌數量顯著減少和是該UASB系統中的主要氫營養型產甲烷菌和乙酸營養型產甲烷菌.與丙酸氧化菌的變化趨勢相反,這兩種產甲烷菌的數量均隨OLR的提高而顯著增加,并在OLR54.0kgCOD/(m3·d)條件下達到最大值.

升流式厭氧污泥床；有機負荷率；丙酸氧化菌；產甲烷菌；熒光定量PCR

厭氧生物處理技術廣泛用于處理各種有機廢棄物,同時回收甲烷作為清潔能源[1-3].有機物的厭氧生物處理過程包括4個步驟:水解發酵、產氫產乙酸、同型產乙酸和產甲烷作用.這4個步驟的代謝平衡是保證厭氧反應器高效運行的關鍵因素[4].然而,當系統遭受溫度、有機負荷率、毒性物質等沖擊時,以上4個步驟將變得不平衡,從而導致揮發酸大量積累,進而使得系統運行失敗[5-6].在這些積累的揮發酸中,丙酸通常占有較大比重,主要是由于丙酸的厭氧降解是一個高度吸能的過程,很難自發進行.此外,丙酸降解還需要產甲烷菌或其他耗氫菌的協同作用,所以其伴生菌的活性和數量對丙酸降解也有一定影響.

在產甲烷環境中,丙酸的降解是通過丙酸氧化菌和產甲烷菌的互營協作來完成的,其在有機物厭氧降解過程中起著重要的作用[7].一方面丙酸氧化菌將丙酸轉化為乙酸和H2/CO2,為產甲烷菌提供底物;另一方面產甲烷菌通過消耗乙酸和H2/CO2,為丙酸氧化菌解除產物的反饋抑制作用,同時為丙酸氧化菌提供能量.丙酸氧化菌的這種代謝方式使其分離培養十分困難,導致只有少數丙酸氧化菌被分離和鑒定[5].從系統發育關系看,已鑒定的丙酸氧化菌主要分布在變形菌門(Proteobacteria)的屬和屬中,以及厚壁菌門(Firmicutes)中低G+C含量、革蘭氏陽性菌的屬和屬中[5].丙酸氧化菌存在于各種厭氧生境中[8-10].它們的組成和分布受到諸多因素的影響,包括丙酸濃度,溫度,pH值等[11-13].

盡管關于丙酸氧化菌定性和定量分析的研究已有報道.然而,不同運行條件下互營丙酸氧化菌群定量分析的相關報道仍然較少.前期研究發現,在處理制糖廢水的UASB反應器中,和是主要的丙酸氧化菌,而和是主要的產甲烷菌[14].因此,本研究針對這4個屬中已鑒定的丙酸氧化菌和產甲烷菌,采用實時熒光定量PCR技術(qPCR)分析其隨有機負荷率(OLR)提高的演替規律,為強化反應器運行效能及穩定性提供理論基礎.

1 材料與方法

1.1 反應器運行控制

試驗裝置為UASB反應器,其有效容積為11L.試驗廢水為稀釋的制糖廢水,添加尿素和KH2PO4使得廢水的COD:N:P為200~300:5:1,并補充微生物生長所必須的微量元素及維生素等[15].在溫度(35±1)℃,水力停留時間(HRT)24h,進水COD為1000mg/L, pH值為6.8~7.2條件下啟動UASB反應器,然后將UASB的HRT逐漸縮短至8h.待運行穩定后,保持HRT為8h,將進水COD逐漸增加至 2000,4000,8000,12000, 18000mg/L,使得反應器的OLR分別為6.0(15d)、12.0(13d),24.0(19d),36.0(21d),54.0kg/(m3?d)(31d).每次改變OLR均在前一次運行達到穩定時進行.每次運行達到穩定后從污泥床取樣,保存至-20℃備用.

1.2 分析項目及方法

pH值和生物量采用標準方法測定[16],產氣量通過濕式氣體流量計(LML-1,長春汽車濾清器有限責任公司)測定,氣體組成和揮發酸組成采用氣相色譜儀測定(SP-6800A和SP6890,山東魯南瑞虹化工儀器有限公司).

1.3 DNA提取及qPCR

稱取0.15g污泥(濕重),采用DNA提取試劑盒(MO Bio Laboratories,Inc,Carlsbad,CA,USA)提取厭氧活性污泥總DNA.DNA濃度用分光光度計測定(Thermo Fisher Scientific Inc.USA).

根據和中已鑒定物種的16S rRNA基因序列設計特異引物,引物序列見表1[13].qPCR分析采用絕對定量方式.標準樣品為包含目的基因片段融合質粒,用超純水進行10倍梯度稀釋(101~107).標準樣品和待測樣品同時進行qPCR分析. qPCR在熒光定量PCR系統(7500型, ABI, USA)中完成.所用熒光染料為SYBR green I.反應體系為: SYBR Green PCR Master Mix (Toyobo Co.,LTD., Japan)10μL,DNA樣品3μL,引物各1μL, ROX 0.04μL, 4.96μL H2O.反應程序: 94℃預變性1min,94℃ 15s, 58℃30s,72℃ 35s,40循環.每個樣品設置3個重復.以達到對數增長時的循環數(C值)為橫坐標,標準質粒數目的對數值為縱坐標繪制標準曲線(圖1).

表1 qPCR中所用引物序列

圖1 qPCR中丙酸氧化菌和產甲烷菌標準曲線

2 結果與討論

2.1 UASB運行效能

在35℃、HRT8h條件下,考察了OLR提高對UASB反應器運行效能的影響.結果表明,在OLR為6.0~54.0kgCOD/(m3·d) 條件下,COD去除率高達92.0%以上(表2).當OLR分階段從6.0逐漸提高至54.0kgCOD/ (m3·d)時,出水揮發酸濃度提高了0.6~3.8倍.當OLR為6.0kgCOD/(m3·d)時,出水中乙酸和丙酸含量相當,分別為47.5,46.0mg/L.然而,有機負荷率的提高使得丙酸含量在總揮發酸中比例提高到55.2%~ 62.4%之間.隨著有機負荷率的不斷提升,UASB的生物量和比產甲烷速率也逐漸增加.以前的研究表明,當UASB處理水葫蘆汁液和乙酰氨基苯璜酰氯(p-ASC)生產廢水時的最佳OLR分別為8.9,7.0kgCOD/ (m3·d),其COD去除率可達到86.6%和100%[17-18].

表2 不同OLR條件下UASB反應器運行特征

2.2 丙酸氧化菌的qPCR分析

厭氧生物處理反應器的運行效能與系統中的微生物群落結構密切相關.前期研究發現該UASB中的主要丙酸氧化菌在分類學上屬于屬和屬[14].因此,本研究針對上述2個屬中已鑒定的丙酸氧化菌,通過qPCR探討了UASB反應器在OLR為6.0,12.0,24.0,36.0, 54.0kgCOD/(m3·d)條件下丙酸氧化菌的數量.結果表明,有3種已鑒定丙酸氧化菌存在于所有檢測的樣品中,分別是、和(圖2)其中,和是2個專性互營菌,只有與產甲烷菌共培養時才能生長[5].而除了能與產甲烷菌共培養外,還能在一些簡單底物上進行純培養[5].它們通過甲基丙二酰-輔酶A途徑(MMC)降解丙酸[19-21].

圖2 不同OLR條件下丙酸氧化菌定量分析

丙酸氧化菌的qPCR分析表明,當OLR為6.0kgCOD/(m3·d)時,、和的含量分別為:355,681,1.2×103個16S rRNA 基因拷貝數/ng DNA.和是該條件下的主要丙酸氧化菌,二者總數為1.9×10316S rRNA基因拷貝數/ng DNA,占檢測到丙酸氧化菌總數的84.3%(圖2和圖3).由圖2可知,隨著OLR分階段提高至54.0kgCOD/ (m3·d),所有檢測到丙酸氧化菌的數量逐漸減少.但是從表2可以看出,出水丙酸發生了一定程度的積累,但并不顯著.分析認為,這可能是由于產酸發酵階段沒有產生大量的丙酸,使得丙酸氧化菌可利用的底物減少,進而導致丙酸氧化菌數量的減少.

圖3 不同OLR條件下丙酸氧化菌的相對豐度

另外,本研究發現,在OLR 6.0~54.0kgCOD/ (m3·d)條件下,是UASB反應器中的優勢丙酸氧化菌,其相對豐度為47.9%~58.6%.類似地,也有研究發現,在處理全脂奶粉、蔗糖、混合酸(丁酸、丙酸、乙酸)廢水時,或是優勢丙酸氧化菌[10-11].然而,Shigematsu等的研究發現,在一個以丙酸為唯一碳源的恒化器中,高稀釋率促進生長,而低稀釋率有利于的生長[22].

2.3 產甲烷菌的qPCR分析

作為有機物厭氧消化的最后一步,高效的產甲烷作用對于維持厭氧消化系統的效能是至關重要的.因此,本研究也考察了不同OLR條件下產甲烷菌的數量.如圖4所示,本研究檢測到兩種產甲烷菌,它們是和為氫營養型產甲烷菌,可利用H2/CO2和甲酸進行生長代謝[23].而只能利用乙酸進行生長代謝、產甲烷,它可以利用濃度低至5~20μmol/L的乙酸[21].以前的研究表明,在含有顆粒污泥反應器中,是主要的乙酸營養型產甲烷菌,它們能夠促進污泥顆?；痆23-25].

qPCR分析表明,兩種產甲烷菌的數量均隨OLR的提高而顯著增加.在OLR為6.0kgCOD/(m3·d)條件下,的數量僅為889個16S rRNA 基因拷貝數/ng DNA.當OLR分階段提高至12.0,24.0,36.0, 54.0kgCOD/(m3·d)時,的數量增加了3.3~ 101倍,并在最后一個運行階段達到最大值(9.1×104個16S rRNA基因拷貝數/ng DNA).類似地,的數量也隨OLR的提高而不斷增加.在OLR為6.0,12.0,24.0,36.0,54.0kgCOD/(m3·d)條件下,的數量分別為2.6×104,1.9×105,5.0×105, 7.5×105,1.8×106個16S rRNA基因拷貝數/ng DNA.乙酸營養型產甲烷菌數量的增加使得該反應器出水乙酸濃度低于150mg/L(表2).產甲烷菌數量的增加主要是由于產甲烷菌的底物隨有機負荷率不斷提高而增加所致.

盡管氫營養型產甲烷菌和乙酸營養型產甲烷菌的數量表現出了相同的變化趨勢,但是后者的數量總是比前者高出2個數量級,說明乙酸裂解可能是該系統中主要的產甲烷途徑.以前的研究也表明,大約2/3的甲烷來自乙酸途徑[21].另外,本研究還發現,當OLR￡24.0kgCOD/(m3·d)時,乙酸營養型產甲烷菌的增加幅度高于氫營養型產甲烷菌,其相對豐度從96.7%增加至99.2%.但繼續提高負荷導致乙酸營養型產甲烷菌的相對豐度從99.2%降低至95.1%,說明較高的負荷(336.0kgCOD/(m3·d))對乙酸營養型產甲烷菌的生長產生了一定程度的抑制.研究還表明,高濃度氨氮(33.5g/L)可對乙酸營養型產甲烷路徑產生顯著的抑制作用[26-27].本研究中,UASB反應器中的氨氮濃度總是低于100mg/L,所以并沒有抑制產甲烷作用.

以上結果表明,OLR提高并沒有使丙酸氧化菌和產甲烷菌的組成發生改變,但卻導致它們的數量發生了明顯變化.丙酸氧化菌的數量隨OLR的提高而降低,而產甲烷菌的數量卻隨OLR的提高而增加.

3 結論

3.1 在35℃、HRT8h條件下,當OLR從6.0kgCOD/ (m3·d)分階段提高至54.0kgCOD/(m3·d)時,UASB系統的COD去除率高達92.0%以上,比產甲烷速率從130.5LCH4/(kg COD·d)增加至827.6LCH4/(kg COD·d).

3.2 在OLR 6.0kgCOD/(m3·d)條件下,、和的數量分別為:355、681和1.2×103個16S rRNA 基因拷貝數/ng DNA.它們的數量隨OLR的提高而逐漸減少,這可能是由于產酸發酵階段的發酵類型改變而導致的.

3.3 隨著OLR逐漸提高,產甲烷菌的數量顯著增加.在OLR為54.0kgCOD/(m3·d)條件下,和的數量達到最大值,分別為:9.1×104和1.8×106個16S rRNA基因拷貝數/ng DNA.

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qPCR reveals the succession of syntrophic propionate-degrading consortia with OLR increase.

ZHANG Li-guo1, LI Yan-lin1, BAN Qiao-ying1*, LI Jian-zheng2

(1.College of Environment and Resource, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；2.School of Municipal and Environmental Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China)., 2018,38(8)：2997~3002

To reveal the effects of organic loading rate (OLR) on the performance of upflow anaerobic sludge bed (UASB) reactor and syntrophic propionate-degrading consortia, this study investigated the effects of OLR increase on the treatment efficiency of UASB containing sugar refinery wastewater as substrate. The succession of syntrophic propionate-degrading consortia as OLR increasing was analyzed by quantitative real-time fluorescence polymerase chain reaction (qPCR). The results showed that the COD removal reached above 92.0% in UASB at OLR of 6.0~54.0kgCOD/(m3·d) conditions. qPCR explored that at least three identified species of propionate-oxidizing bacteria (,, and) existed in the UASB system.was dominated in UASB and its quantity was 126~1.2×10316S rDNA copies per ng DNA, accounting for 47.9%~58.6% of the total detectable propionate-oxidizing bacteria. OLR increase from 6.0 to 54.0kgCOD/(m3·d) resulted in all detected propionate-oxidizing bacteria significantly decreased. In addition,andwere the dominant hydrogenotrophic methanogens and acetotrophic methanogens. The number of methanogens was significantly increased with OLR increase and achieved a maximum at OLR of 54.0kgCOD/(m3·d) condition.

upflow anaerobic sludge bed；organic loading rate；propionate-oxidizing bacteria；methnaogens；qPCR

X703.5

A

1000-6923(2018)08-2997-06

張立國(1980-),男,河南安陽人,副教授,博士,主要從事廢水厭氧生物處理研究.發表論文20余篇.

2018-01-18

國家自然科學基金(51708341);山西省“青年三晉學者”支持計劃;山西省高等學校優秀創新團隊支持計劃

* 責任作者, 講師, banqiaoying@163.com