黃土高原不同種植年限紫花苜蓿根系分泌物GC-MS分析

畢博遠(yuǎn)， ,2*

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院， 陜西 楊凌712100；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 楊凌712100)

根系作為植物與土壤的接觸面，不僅是吸收和代謝器官，同時(shí)也是強(qiáng)大的分泌器官[1]。根系分泌物是植物與土壤進(jìn)行物質(zhì)交換和信息傳遞的重要載體物質(zhì), 是植物響應(yīng)外界脅迫的重要途徑, 是構(gòu)成植物不同根際微生態(tài)特征的關(guān)鍵因素, 也是根際對(duì)話(huà)的主要調(diào)控者[2]。根系分泌物對(duì)于生物地球化學(xué)循環(huán)、根際生態(tài)過(guò)程調(diào)控、植物生長(zhǎng)發(fā)育等均具有重要功能, 尤其是在調(diào)控根際微生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能方面發(fā)揮著重要作用，調(diào)節(jié)著植物-植物、植物-微生物、微生物-微生物間復(fù)雜的互作過(guò)程[3]。已有的多數(shù)研究[4-7]，僅是針對(duì)草地地表的研究，其中根系密度、直徑、比表面積、根重以及根冠比等指標(biāo)通長(zhǎng)是研究的主要方向，而對(duì)表層以下的研究相對(duì)較少，因此有關(guān)根系方面地下部分需要進(jìn)一步研究。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用不同的提取方式提取各種植物的根系分泌物，大致分為水培、土培、基質(zhì)培養(yǎng)這三種方法。從植物的根際土壤中提取分泌物(土培)，是最接近于植物自然生長(zhǎng)狀態(tài)的提取方法，相比于水培收集法，這種方法最大的優(yōu)點(diǎn)是更能反映植株在土壤中的實(shí)際分泌情況，而且由于土壤存在機(jī)械阻力，根系分泌作用比較旺盛，土培條件下單位植株干重產(chǎn)生根系分泌物的量要高于溶液培養(yǎng)收集的根系分泌物量[8]。雖然這種方法相較于水培條件易受土壤微生物分解的干擾，但可以反映在自然生長(zhǎng)條件下植物根系分泌的真實(shí)情況，這對(duì)于了解植物根系分泌物組成具有重要意義。目前，相對(duì)來(lái)說(shuō)比較完善的測(cè)試技術(shù)是采用氣象色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)對(duì)根系分泌物進(jìn)行分析。本研究通過(guò)采集不同種植年限(1年、10年、20年、30年)紫花苜蓿‘中苜一號(hào)’的根際土壤，用不同極性的浸提劑(二氯甲烷、乙酸乙酯)提取苜蓿根際土壤根系分泌物，初步明確不同年限其組分含量和典型分泌物間的差異，以期為研究植物-土壤養(yǎng)分互作過(guò)程提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)域

本研究采用的紫花苜蓿根系來(lái)自于中國(guó)科學(xué)院水土保持研究所神木生態(tài)觀(guān)測(cè)站不同種植年限的‘中苜一號(hào)’人工小區(qū)，該站位于神木縣以西14 km處的六道溝流域，北靠長(zhǎng)城，地處毛烏素沙漠的邊緣，屬于黃土高原水蝕風(fēng)蝕交錯(cuò)帶的強(qiáng)烈侵蝕中心，流域面積6.7 km2。該流域基本養(yǎng)分特征是普遍缺氮，部分缺磷、鉀素比較豐富。依據(jù)土壤養(yǎng)分分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，該流域的三大用地(農(nóng)地、草地、林地)含氮量均處于第6級(jí)，速效磷含量農(nóng)用地處于 2 級(jí)，草地和林地處于 4 級(jí)，有機(jī)質(zhì)含量處于 4～6 級(jí)[9]。

1.2 根際土壤的采集

挖取長(zhǎng)勢(shì)相同且無(wú)病蟲(chóng)害的苜蓿根系，根際土壤的采集參照盧豪良等[10]的方法，即先抖落表面土壤，用毛刷輕輕刷掉緊貼根面的大約5 mm的土壤，裝入密封袋中，冷藏。

1.3 根系分泌物的提取

將所采集到的根際土壤研磨過(guò)0.25 mm篩，將上述4種種植年限的根際土壤分別稱(chēng)取5 g置于離心管中，每種年限各取三組作為重復(fù)，分別加入50 ml二氯甲烷(乙酸乙酯)，于30℃的溫度震蕩1 h，再以4℃、5 000 r·min-1的條件離心10 min，取上清液并用0.45 μm濾膜過(guò)濾，最后用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40℃條件下將其減壓濃縮至3～5 ml，冷藏于-20℃冰箱，用于GC-MS測(cè)定。

1.4 GC-MS分析條件

氣相色譜儀：津島GC-MSQP 2010型氣象色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀。GC-MS Solution色譜工作站，標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)為美國(guó)NIST質(zhì)譜檢索數(shù)據(jù)庫(kù)。GC-MS分析條件主要根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)[11-16]執(zhí)行。GC條件：色譜柱：Rtx-5ms (30 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣：He；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：80℃；進(jìn)樣口溫度：250℃；升溫程序：80℃為起始,以15 ℃·min-1升溫至200℃，以8 ℃·min-1升溫至250℃，保持18分鐘。進(jìn)樣量：1 μL，不分流。MS條件：離子源溫度：230℃；電離方式：EI；電子能量：70eV；溶劑延遲時(shí)間：2.5 min；質(zhì)量掃描范圍：10～450 amu；采集方式：SCAN掃描。

1.5 數(shù)據(jù)分析

本研究采用Excel和SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)GC-MS分析，將相似度在80%以上的物質(zhì)進(jìn)行了對(duì)比，并得到根系分泌物的總離子流圖見(jiàn)圖1與圖4。

2.1 二氯甲烷組分GC-MS鑒定結(jié)果

結(jié)合圖1與表1所示，在二氯甲烷提取的組分中，種植1年苜蓿共檢測(cè)出29種化合物，主要有烷烴類(lèi)26種、脂類(lèi)1種、醇類(lèi)1種、酚類(lèi)1種，其中烴類(lèi)得相對(duì)含量較大，相對(duì)含量為82.20%，鄰苯二甲酸二乙酯所占比例為3.39%，這是除了烴類(lèi)物質(zhì)所含最多的其他化合物；種植10年苜蓿共檢測(cè)出34種化學(xué)物，主要有烷烴類(lèi)26種、脂類(lèi)4種、醇類(lèi)3種，酸類(lèi)1種，其中烷烴類(lèi)的相對(duì)含量較大，相對(duì)含量為79.71%，在烷烴類(lèi)物質(zhì)中，二十一烷占其比例為30.63%、四十烷所占比例為14.62%、三十五烷所占比例為12.62%；種植20年苜蓿共檢測(cè)出33種化學(xué)物，其中烷烴類(lèi)28種、脂類(lèi)2種、醇類(lèi)2種、酚類(lèi)1種，烷烴類(lèi)的相對(duì)含量為76.27%，在烷烴類(lèi)物質(zhì)中，二十一烷所占比例為36.54%、四十烷所占比例為24.88%；種植30年苜蓿共檢測(cè)出39種化學(xué)物，其中烷烴類(lèi)31種、脂類(lèi)3種、醇類(lèi)1種、酚類(lèi)1種、酸類(lèi)2種、醚類(lèi)1種，烷烴類(lèi)的相對(duì)含量為82.1%，其中二十一烷所占烷烴類(lèi)化合物的比例為32.55%。

圖1 二氯甲烷提取四種種植年限苜蓿根系分泌物GC-MS圖譜Fig.1 GC-MS map of root exudates of alfalfa in four planting years using dichloromethane

如圖2所示，在每種種植年限中烷烴所占比重較大，都占75%以上，可推測(cè)出由二氯甲烷提取的苜蓿根際土壤中典型根系分泌物是一些烷烴類(lèi)化合物，且隨著種植年限的增長(zhǎng)烷烴類(lèi)化合物的種類(lèi)逐年增多。此外，每種年限的根際土壤中我們還提取到少量的非烷烴類(lèi)化合物。圖2顯示，在種植年限1年的苜蓿根系土壤中，提取到的化合物種類(lèi)最少， 10年與20年的數(shù)量接近，而30年提取到的化合物種類(lèi)最多。

圖2 二氯甲烷提取不同種植年限苜蓿根系分泌物化合物種類(lèi)與數(shù)量Fig.2 The types and quantities of root exudates of different planting years’ alfalfa extracted fromdichloromethane注：不同小寫(xiě)字母表示各年限化合物數(shù)量間差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)Note：The different lowercase letters indicate that the number of compounds in different years has reached a significant level at the 0.05 level

如圖3所示，本研究選取了五種種植年限共同提取到的且相對(duì)含量較大的6種化合物，在20年苜蓿中，除二十一烷以外四十烷的含量顯著高于其他年限(P<0 .05)，同時(shí)三十六烷的含量也顯著高于其他年限(P<0.05)。由表1可知，30年苜蓿根系分泌物無(wú)論從化合物種類(lèi)與數(shù)量來(lái)講都相對(duì)分泌比較旺盛，但僅二十一烷的相對(duì)含量顯著高于其他年限。并且，除了1年苜蓿以外各年限的紫花苜蓿二十一烷含量都占比很大，且呈現(xiàn)出相對(duì)含量逐年顯著遞增的趨勢(shì)(P<0.05)，這可能說(shuō)明二十一烷是‘中苜一號(hào)’的典型分泌物。

圖3 二氯甲烷提取四種年限苜蓿根系分泌物共有組分Fig.3 Common components of dichloromethane extractionof four years of alfalfa root exudates注：不同小寫(xiě)字母表示各年限化合物相對(duì)含量間差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)Note：The different lowercase letters indicate that the relative content of compounds in different years has reached at the 0.05 level

表1 二氯甲烷提取四種種植年限苜蓿根系分泌物主要組分Table 1 Main components of dichloromethane extraction of four planting years Alfalfa root exudates

注：同行不同小寫(xiě)字母表示各年限分泌物質(zhì)相對(duì)含量間差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)

Note：The different lowercase letters in the same row indicate that the relative content of secreted substances in different years has reached at the 0.05 level

2.2 乙酸乙酯組分GC-MS鑒定結(jié)果

結(jié)合圖4與表2所示，乙酸乙酯提取的組分中，種植1年苜蓿共檢測(cè)出11種化合物，主要有烴類(lèi)10種、酮類(lèi)1種，烴類(lèi)幾乎占據(jù)全部，相對(duì)含量為99.66%，而乙烯酮的相對(duì)含量?jī)H為0.41%；種植10年苜蓿共檢測(cè)出17種化學(xué)物，主要有烴類(lèi)15種、醇類(lèi)1種，酸類(lèi)1種，烷烴類(lèi)的相對(duì)含量較大，相對(duì)含量為94.2%，在烴類(lèi)物質(zhì)中，二十一烷占其比例為22.49%、三十六烷所占比例為20.43%、二十五烷所占比例為14.64%；種植20年苜蓿共檢測(cè)出18種化學(xué)物，其中烴類(lèi)16種、酸類(lèi)1種、醇類(lèi)1，烴類(lèi)的相對(duì)含量為95.97%，在烴類(lèi)物質(zhì)中，二十一烷所占比例為46.44%、四十烷所占比例為21.92%；種植30年苜蓿共檢測(cè)出41種化學(xué)物，其中烴類(lèi)30種、脂類(lèi)5種、醇類(lèi)3種、酸類(lèi)3種，烴類(lèi)的相對(duì)含量達(dá)到了90.2%。其中二十一烷所占烴類(lèi)化合物的比例為33.25%。

表2 乙酸乙酯提取四種種植年限苜蓿根系分泌物主要組分Table 2 Main components of ethyl acetate extraction of four planting years Alfalfa root exudates

注：同行不同小寫(xiě)字母表示各年限分泌物質(zhì)相對(duì)含量間差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)

Note：The different lowercase letters in the same row indicate that the relative content of secreted substances in different years has reached at the 0.05 level

如圖5所示，在每種種植年限中烷烴所占比重較大，都占90%以上，可推測(cè)出由乙酸乙酯提取的苜蓿根際土壤中典型根系分泌物也是一些烷烴類(lèi)化合物，且隨著種植年限的增長(zhǎng)烷烴類(lèi)化合物的種類(lèi)逐年增多，并且30年的提取結(jié)果顯著高于其他年限(P<0.05)。由表2所示，在種植年限1年的苜蓿根系土壤中，提取到的化合物種類(lèi)僅兩種且99.66%是烷烴，10年比20年提取到的化合物種類(lèi)稍多，而30年提取到的化合物種類(lèi)最多。此外，在30年的提取結(jié)果中酸類(lèi)、醇類(lèi)、脂類(lèi)化合物均顯著高于其他年限(P<0.05)。

圖5 乙酸乙酯提取不同種植年限苜蓿根系分泌物化合物種類(lèi)與數(shù)量Fig.5 The types and quantities of root exudates of different planting years’ alfalfa extracted from ethyl acetate注：不同小寫(xiě)字母表示各年限化合物數(shù)量間差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)Note：The different lowercase letters indicate that the number of compounds in different years has reached at the 0.05 level

如圖6所示，本研究選取了4種種植年限共同提取到的且相對(duì)含量較大的4種化合物，包括二十烷、二十一烷、三十六烷和四十烷。這與二氯甲烷提取結(jié)果相似，很可能說(shuō)明這幾種物質(zhì)是‘中苜一號(hào)’的 典型分泌物，并且二十一烷的相對(duì)含量在各年限中都處于優(yōu)勢(shì)地位，并隨著年限增長(zhǎng)相對(duì)含量逐年顯著增加(P<0.05)。

3 討論

圖6 乙酸乙酯提取四種年限苜蓿根系分泌物共有組分Fig.6 Common components of ethyl acetate extraction of four years of alfalfa root exudates注：不同小寫(xiě)字母表示各年限化合物相對(duì)含量間差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)Note：The different lowercase letters indicate that the relative content of compounds in different years has reached at the 0.05 level

在一定的時(shí)間和空間條件下，植物根系分泌物發(fā)生的變化可能與土壤環(huán)境、氣候環(huán)境以及其他物種入侵有重要關(guān)系。首先，根際土壤環(huán)境主要分為土壤微生物活性、土壤酶活性和土壤的相關(guān)理化性質(zhì)等因素。根際微生物的存在可大大促進(jìn)根系分泌物的釋放，它可以通過(guò)改變根際營(yíng)養(yǎng)狀況、植物體內(nèi)激素含量來(lái)改變植物體內(nèi)生理生化過(guò)程，從而影響根系分泌物的種類(lèi)和數(shù)量[16]；根際微生物所產(chǎn)生的酶會(huì)礦化分解土壤中的有機(jī)物質(zhì)，提高根際土壤的養(yǎng)分有效性，與此同時(shí)可能會(huì)造成養(yǎng)分脅迫以及影響植物光合作用等，從而影響根系分泌物的分泌與種類(lèi)。張炳學(xué)等[17]對(duì)4種年限苜蓿草地剖面深度為0～40 cm的土壤微生物活性進(jìn)行測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，土壤PLFA(磷脂脂肪酸)總量和細(xì)菌、真菌、G+、G-、放線(xiàn)菌等其他菌群PLFA含量在0～20 cm土層中，均以10年苜蓿樣地土壤中PLFA含量最高；20～40 cm土壤深度中，1年、10年和20年樣地土壤中各PLFA含量均較高。本研究在提取到的10～40 cm剖面深度的苜蓿根際土壤GC-MS結(jié)果顯示，10年、20年苜蓿的化合物種類(lèi)與數(shù)量均與1年、30年苜蓿存在較大差異。這說(shuō)明各年限苜蓿草地中微生物作用的差異性對(duì)其根系分泌產(chǎn)生了重要的影響。根際土壤是植物生長(zhǎng)的微環(huán)境，土壤溫濕度、土壤水分等理化性質(zhì)都對(duì)根系分泌物產(chǎn)生影響。土壤中含水量的缺豐影響著根系的分泌情況，因?yàn)樗置{迫會(huì)造成某些植物根系分泌較多的有機(jī)酸。植物的根際土壤結(jié)構(gòu)不同，尤其是土壤通透性不同，空氣通透性好的土壤的氧化還原電位明顯好于通透性低的土壤，進(jìn)而導(dǎo)致某些金屬離子元素被活化然后毒害土壤，造成逆境脅迫從而影響根系分泌物的種類(lèi)和數(shù)量。植被演替和其他物種入侵同樣是影響根系分泌物重要原因。從提取結(jié)果可知，用兩種浸提劑提取不同種植年限的紫花苜蓿根系分泌物， 30年苜蓿提取到的有機(jī)物種類(lèi)和數(shù)量都明顯多于其他年限。因?yàn)殡S著時(shí)間推移，人工苜蓿草地有3個(gè)階段的演替過(guò)程，1～10年的人工草地基本以苜蓿為主，在生長(zhǎng)的10～30年苜蓿人工草地，長(zhǎng)芒草會(huì)逐漸成為優(yōu)勢(shì)物種，而超過(guò)30年以后，鐵桿蒿會(huì)成為主要物種[18-20]。由于植被演替的原因進(jìn)而可能會(huì)發(fā)生化感作用，影響根系分泌物的正常代謝，以致于發(fā)生自毒作用，試驗(yàn)結(jié)果顯示在種植10年、20年苜蓿遠(yuǎn)低于30年根系分泌物的數(shù)量和種類(lèi)，這可能是因?yàn)檐俎Ｅc長(zhǎng)芒草共生條件下，由于化感作用導(dǎo)致了紫花苜蓿根系分泌物的種類(lèi)和數(shù)量的相對(duì)減少。

評(píng)價(jià)土壤肥力的指標(biāo)包括土壤養(yǎng)分因素、物理、化學(xué)以及生物因素。通過(guò)植物-土壤養(yǎng)分互作、微生物的作用可以促進(jìn)植物根系的分泌，從而提高土壤養(yǎng)分有效性[21]。本研究著重以不同生長(zhǎng)年限苜蓿為變量出發(fā)，通過(guò)GC-MS技術(shù)對(duì)苜蓿根系分泌物的化學(xué)組成以及相對(duì)含量進(jìn)行分析，明確不同年限紫花苜蓿根系分泌物之間的差異性，從而探討隨著時(shí)間的推移苜蓿草地肥力變化特征并提供科學(xué)依據(jù)。

影響苜蓿的根系分泌物是多方面因素綜合作用的，對(duì)于本研究，影響較大的可能是植被演替，以及氣候因素。植被演替所產(chǎn)生的相關(guān)化感物質(zhì)以及脅迫作用都會(huì)對(duì)根系分泌物的產(chǎn)生起到很大的影響。六道溝流域地處黃土高原蝕風(fēng)蝕交錯(cuò)帶的強(qiáng)烈侵蝕中心，相比室內(nèi)土培條件，此地氣候因素更加復(fù)雜與多變。但本研究?jī)H針對(duì)根系分泌物本身進(jìn)行相關(guān)研究，但并未對(duì)相關(guān)幾個(gè)重要的影響因素進(jìn)行相關(guān)性分析，包括根際土壤微生物以及根際土壤的理化性質(zhì)并未涉及。

4 結(jié)論

苜蓿的根系分泌物主要含有烷烴類(lèi)、酯類(lèi)、醇類(lèi)、酸類(lèi)、酚類(lèi)、酮類(lèi)、醚類(lèi)化合物，二氯甲烷和乙酸乙酯提取到的化合物中烷烴類(lèi)化合物所占比重均在75%以上；二氯甲烷提取結(jié)果中，提取到的化合物種類(lèi)數(shù)量為：30年>10年>20年>1年；乙酸乙酯提取結(jié)果中，提取到的化合物種類(lèi)數(shù)量為：30年>10年>20年>1年；二氯甲烷和乙酸乙酯提取結(jié)果中均以二十一烷相對(duì)含量最大，且含量隨種植年限增長(zhǎng)遞增。