荒漠植物沙鞭(Psammochloa villosa)種質(zhì)資源收集及譜系遺傳分化初探

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(青海師范大學(xué)，青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室，青海省自然地理與環(huán)境過程重點實驗室，青藏高原環(huán)境與資源教育部重點實驗室，青海 西寧 810008)

沙鞭(PsammochloavillosaBor.)是禾本科(Poaceae)、針茅族(Stipeae)、沙鞭屬(Psammochloa)的一種多年生草本植物，主要分布于我國內(nèi)蒙古高原及其毗鄰沙區(qū)，如巴丹吉林沙漠、馬蘭布和沙漠、騰格里沙漠、庫布齊沙漠、毛烏素沙地及甘肅河西走廊沙區(qū)、寧夏中北部和陜西北部沙區(qū)[1-2]，是這些極端沙地環(huán)境下分布的關(guān)鍵或唯一草本物種，不僅具有重要的生態(tài)價值，而且也是我國沙漠地區(qū)重要的優(yōu)勢牧草。沙鞭是單種屬沙鞭屬的一個模式種，最初系由Hitchcock[3]于1927年基于館藏在美國自然歷史博物館的兩份模式標(biāo)本而發(fā)表的一個新物種，命名為PsammochloamongolicaHitchc.，這個物種得到我國諸多學(xué)者的普遍接受與認(rèn)可[4-5]。此后，諸多學(xué)者對沙鞭的系統(tǒng)位置和物種名稱進(jìn)行了多次歸隸和修訂，尤其是1951年Bor[6]將沙鞭種名重新修訂為PsammochloavillosaBor.，并詳細(xì)闡述了其外部形態(tài)特征、生境及地理分布，是沙鞭分類學(xué)上的一個里程碑，特別是這些新的描述和修訂至今仍被國內(nèi)外絕大多數(shù)學(xué)者普遍采用[1-2,7-8]。沙鞭具長而橫走的根狀莖，圓錐花序緊密直立，小穗具有短柄、淡黃色或白色，外稃密被長柔毛等特征，主要通過克隆繁殖進(jìn)行后代繁育，具有很強(qiáng)的建群能力，是我國內(nèi)蒙古沙地及其毗鄰地區(qū)的先鋒植物和建群草本物種；對流動沙丘具有很強(qiáng)的適應(yīng)性，是沙地植物群聚的優(yōu)勢種，是典型的旱生和沙生植物，對維持這一區(qū)域內(nèi)的生態(tài)系統(tǒng)平衡具有不可低估的作用[2,7]。此外，沙鞭具有較強(qiáng)的耐旱、耐寒、耐堿以及抗病和抗風(fēng)沙能力，加之花序相對粗長、穗多粒大等優(yōu)點，是農(nóng)牧業(yè)上禾草良種繁育和牧草利用的重要基因資源。

目前，國內(nèi)外學(xué)者已從形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、生態(tài)學(xué)等方面對沙鞭進(jìn)行了研究報道。在形態(tài)學(xué)方面，董鳴[9]通過切斷根莖對根莖禾草沙鞭和賴草克隆生長影響的比較研究，發(fā)現(xiàn)斷莖處理對沙鞭基株的根莖、地上枝、主根莖等相關(guān)性狀特征增量顯著降低，但對沙生植物賴草卻幾乎無影響，表明沙鞭的克隆整合和生長特性賦予其在極端惡劣沙生環(huán)境中的生存能力；在生理學(xué)方面，黃振英等[10]通過對沙鞭種子在沙丘上萌發(fā)策略及幼苗耐干燥特性的研究表明，隨著沙埋深度的增加，其種子萌發(fā)率和幼苗出土率下降；在生態(tài)學(xué)方面，徐翥驊等[11]通過對沙鞭和羊柴不同根圍的土層土壤樣品進(jìn)行AM真菌空間分布及其與土壤因子的相關(guān)性研究，發(fā)現(xiàn)AM真菌能與沙鞭和羊柴形成良好共生關(guān)系；但關(guān)于荒漠植物沙鞭遺傳多樣性的研究起步較晚且報道甚少，僅見王可青等[12]采用等位酶電泳技術(shù)，對毛烏素沙地沙鞭種群進(jìn)行了遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)沙鞭遺傳變異水平低于同類植物，并且絕大多數(shù)遺傳變異存在于種群間；此后，Li[13]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對來源于我國西北地區(qū)7個沙鞭種群的遺傳變異和克隆多樣性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)沙鞭天然種群的遺傳變異水平較高，種群間遺傳分化遠(yuǎn)大于種群內(nèi)，同時還發(fā)現(xiàn)利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)獲得的沙鞭遺傳多樣性參數(shù)值比利用等位酶電泳技術(shù)得到的數(shù)值準(zhǔn)確、可靠。上述研究不僅對系統(tǒng)評價沙鞭的抗旱性，篩選抗旱性強(qiáng)、表現(xiàn)好的種質(zhì)資源提供了重要理論依據(jù)，而且能夠促進(jìn)牧草品種改良和抗逆性篩選，并為揭示克隆植物與沙生環(huán)境關(guān)系及其潛在進(jìn)化意義提供基礎(chǔ)資料。據(jù)此，本文研究集中在內(nèi)蒙古高原及其毗鄰地區(qū)調(diào)查沙鞭的具體自然地理分布、種質(zhì)資源收集結(jié)果以及初步利用nrITS序列進(jìn)行的遺傳分化研究，旨在為沙鞭未來的研究和資源利用提供科學(xué)合理的資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料全部來源于野外采集的新鮮幼嫩、無病蟲害，用硅膠干燥的沙鞭葉片，從采集材料中選取具有代表性的60個沙鞭種群，再從每個種群材料中選擇3個具有標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)和代表性的個體作為研究材料，進(jìn)行nrITS序列的擴(kuò)增和測序。此外，本研究選擇絲穎針茅(Stipacapillacea)作為外類群。

1.2 試驗方法

1.2.1野外調(diào)查和群體采樣 在廣泛查閱現(xiàn)有沙鞭文獻(xiàn)資料，中國科學(xué)院西北高原生物研究所青藏高原生物標(biāo)本館(HNWP)、中國科學(xué)院植物研究所標(biāo)本館(PE)等館藏標(biāo)本，以及中國數(shù)字植物標(biāo)本，地方植物志和各類野外調(diào)查研究結(jié)果對荒漠植物沙鞭天然分布產(chǎn)地記錄基礎(chǔ)上，詳細(xì)標(biāo)記其產(chǎn)地，發(fā)現(xiàn)荒漠植物沙鞭主要分布于我國內(nèi)蒙古高原的幾個沙地，因此將上述所有標(biāo)本采集地視為重點采集區(qū)域，并對所有地點進(jìn)行群體采樣，同時對其毗鄰地區(qū)是否有該物種分布也進(jìn)行較為全面的野外調(diào)查和群體采樣；具體調(diào)查范圍為37°25'29.1''～43°7'11.8'' N，104°40'5.0''～112°54'23.5'' E，海拔976～1 707 m。發(fā)現(xiàn)沙鞭典型種群進(jìn)行GPS定位，同時詳細(xì)記錄每個種群的生態(tài)因子信息(如年平均溫度、年降水量、經(jīng)緯度、海拔高度等)，并注意觀察其生長環(huán)境(如溫度、坡度、坡向及土壤等)。

1.2.2nrITS提取、擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析 本研究采用改進(jìn)的CTAB法[14]，從硅膠干燥的沙鞭植物葉片中提取全基因組DNA；然后，選用引物ITS1和ITS4進(jìn)行nrITS序列的擴(kuò)增和測序，引物序列為ITS1：5′-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參考劉玉萍[15]、王倩[16]等學(xué)者的相關(guān)研究內(nèi)容。擴(kuò)增反應(yīng)是在ABI公司生產(chǎn)的ABI 9700 PCR儀上進(jìn)行，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(圖 1)，PCR產(chǎn)物由北京華大基因測序有限公司進(jìn)行常規(guī)測序。所有序列用軟件Clustal X 1.81[17]和進(jìn)行比對并加以手工校對；DnaSP 5.0軟件[18]統(tǒng)計每個片段的插入缺失和單核苷酸多態(tài)性；采用啟發(fā)式搜索和MrBayes 3.1[19]進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和分析，并檢驗它們之間的遺傳差異，給出重復(fù)1 000次各分支的自展支持率BV(bootstrap value)值和貝葉斯系統(tǒng)樹(bayesian inference，BI)后驗概率PP值。

圖1 PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.1 The gel electrophoresis of nrITS PCR product注：DNA marker為2000bp。從上到下由2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp以及100bp共6條雙鏈DNA片段組成Note：DNA marker is 2000bp. From top to bottom, there are 6 double-stranded DNA fragments of 2000bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp and 100bp

2 結(jié)果與分析

通過我們2013-2016年的詳細(xì)調(diào)查，目前已經(jīng)收集到中國甘肅、寧夏、陜西以及內(nèi)蒙古等絕大多數(shù)野外自然地理分布區(qū)的沙鞭種群種質(zhì)資源材料，共有60個種群(圖2)，每個種群收集到5～10株，間隔200 m以上，其中包括450個的個體DNA材料、以及45個種群的成熟種子，每個種群采集不少于5個的個體材料為憑證標(biāo)本。此外，我們對沙鞭60個種群的采集地、經(jīng)緯度、海拔和生境等也作了詳細(xì)記錄(表1)。上述所有憑證標(biāo)本、DNA種群樣品和成熟種子等均暫且保存于青海師范大學(xué)青藏高原植物標(biāo)本室(QHNUBI)。

圖2 沙鞭種質(zhì)資源采集地理分布圖Fig.2 Sampling locations of Psammochloa villosa in the Inner Mongolian Plateau

表1 沙鞭種質(zhì)資源采集信息表Table 1 Sampling information of Psammochloa villosa

續(xù)表1

續(xù)表1

注：NX，寧夏；NMG，內(nèi)蒙古；SX，陜西

Note: NX, Ningxia; NMG, Neimenggu; SX, Shanxi

基于nrITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，兩種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)極為相同，只是支持率略有不同(圖3)；同時，我們還發(fā)現(xiàn)所有參試種群核糖體核基因序列存在顯著差異，將它們分成兩個較為明顯的譜系遺傳分支，即一個分支(A)主要由生長于內(nèi)蒙古高原東部的所測個體構(gòu)成，并在兩種方法中得到100%的BV值和100%的PP值；另一分支(B)主要由采自內(nèi)蒙古高原西部的所測個體組成，在兩種方法中也得到較高支持率100%的BV值和100%的PP值。

3 討論

核基因組核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(nuclear ribosomal internal transcribed spacer，nrITS)已經(jīng)成為被子植物特別是較低分類階元分子系統(tǒng)學(xué)、譜系地理學(xué)和生物多樣性研究中應(yīng)用最為廣泛的一個核核糖體片段，尤其是它現(xiàn)已發(fā)展成為種子植物DNA條形碼的核心條形碼[20]。通常nrITS片段不僅長度穩(wěn)定和通用性好[21]，而且變異速率較高，能夠提供較豐富的遺傳變異信息位點[22]，因而它已被國內(nèi)外諸多學(xué)者普遍用來從分子水平上探討植物的譜系遺傳分化研究，并取得一系列研究成效[23-25]。沙鞭作為一種重要的防風(fēng)固沙植物種質(zhì)資源，它已經(jīng)引起廣泛關(guān)注，并對其開展了種子萌發(fā)特性、克隆生長特點、遺傳多樣性等方面的諸多研究，本研究團(tuán)隊也已對其主要自然地理分布區(qū)的種質(zhì)資源進(jìn)行了3年的野外調(diào)查和群體采樣。據(jù)此，利用nrITS序列對沙鞭已有種群材料進(jìn)行了相關(guān)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)沙鞭的所有參試類群構(gòu)成一個單系，nrITS序列間存在顯著差異，能將它們分成較為明顯的譜系遺傳分支， 表明該物種種群間遺傳分化顯著，這可能與其對不同荒漠條件具有較強(qiáng)適應(yīng)能力有關(guān)。在野外調(diào)查和群體采樣中也發(fā)現(xiàn)，內(nèi)蒙古高原東西部的沙鞭種群在植株高度、葉片被毛狀況、圓錐花序和小穗長度、外稃被毛等許多外部形態(tài)特征上存在著較大差異。荒漠植物沙鞭的遺傳分化、種群動態(tài)及分布式樣等科學(xué)問題需要以后完成全面野外調(diào)查和群體采樣，并在種群水平上對多種遺傳背景分子數(shù)據(jù)綜合分析和模擬后，才能闡明全球氣候變化尤其是第四紀(jì)冰期是如何深刻影響我國西北干旱荒漠區(qū)荒漠植物沙鞭種群遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳分化及種群動態(tài)歷史的原因。

因此，能夠開展和需要完成研究工作主要包括：⑴通過群體水平上廣義形態(tài)性狀的統(tǒng)計分析，闡明沙鞭種群內(nèi)和種群間遺傳多樣性及其空間分布格局，尋找引起沙鞭變異的主要表型性狀，探討沙鞭表型性狀變異、以及其與地理和生態(tài)因子之間的相關(guān)性。⑵模擬干旱梯度脅迫，對沙鞭種子萌發(fā)期和幼苗期進(jìn)行抗旱性研究，篩選抗逆性強(qiáng)的優(yōu)良種質(zhì)資源種群。⑶利用不同類型的分子標(biāo)記，從群體水平上比較和評價沙鞭的遺傳多樣性，探討其遺傳多樣性特點和遺傳結(jié)構(gòu)模式。⑷采用多種不同遺傳背景分子標(biāo)記的聯(lián)合分析，并利用生態(tài)位(ENM)模擬相結(jié)合的方法，系統(tǒng)探討沙鞭種群遺傳變異的地理分布式樣，結(jié)合現(xiàn)代植物分子群體遺傳學(xué)分析方法，全面追述其現(xiàn)代分布種群的進(jìn)化歷史、分布格局形成的歷史原因、溫度下降時的避難所以及回升后的擴(kuò)散/回遷路線。并且還可利用已采集的沙鞭種質(zhì)資源材料，采用比較基因組學(xué)等分子生物學(xué)和遺傳學(xué)方法，研究和提取沙鞭的優(yōu)良抗逆基因，然后通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將其轉(zhuǎn)入到其它禾本科牧草(如披堿草、針茅)和農(nóng)作物 (如小麥、玉米、青稞)中，篩選培育適合不同用途且抗逆性強(qiáng)的新品種。總之，通過長時間全面系統(tǒng)的野外考察和群體采樣，目前本研究團(tuán)隊已經(jīng)收集到較為完整的沙鞭種質(zhì)資源，不僅為其不同基因型多個種群種質(zhì)資源的收集和整理提供了材料基礎(chǔ)，而且也為今后研究和利用這些種質(zhì)資源提供了保證。

圖3 基于nrITS序列數(shù)據(jù)構(gòu)建的最大簡約樹和Bayesian 50%多數(shù)規(guī)則一致性樹，分支上數(shù)字分別代表最簡約樹(MP)的自展支持率和Bayesian后驗概率Fig.3 The most parsimonious tree based on nrITS sequences and 50% of Bayesian majority rule consensus tree based on nrITS sequences. Numbers above the branches indicate bootstrap support and the Bayesian posterior probabilities respectively

4 結(jié)論

本研究通過對沙鞭廣泛的野外考察，共采集沙鞭60個種群的憑證標(biāo)本、450個的個體DNA材料及45個種群的成熟種子；同時，本文還利用DNA分子標(biāo)記對沙鞭譜系分化進(jìn)行了初步探討，發(fā)現(xiàn)沙鞭種群存在明顯的遺傳分化，可能與內(nèi)蒙古高原特殊的地理氣候條件有關(guān)。因此，這種系統(tǒng)種群水平上沙鞭種質(zhì)資源的材料收集，對今后探討沙鞭的遺傳多樣性及其分布格局、適應(yīng)進(jìn)化和分布擴(kuò)散、抗旱適應(yīng)性生理生態(tài)機(jī)制、以及響應(yīng)第四紀(jì)氣候變遷的生物地理學(xué)模式提供重要基礎(chǔ)。