青海省海晏縣線葉嵩草內生細菌的生物功能鑒定及測定

魏立娟， ， *，

(1.甘肅農業大學,甘肅 蘭州730070； 2.青海大學， 青海 西寧810003)

植物內生細菌是指能定殖在健康植物組織內并與植物建立和諧關系的一類微生物[1-2]，隨著植物微生態系統研究的不斷深入，內生細菌的存在和作用已得到廣泛共識[3]。幾乎所有的植物中都伴隨植物內生細菌的存在，其長期生活于植物體內的特殊環境中[4-5]，內生細菌可利用風、土壤顆粒、水、農業器具等多種外力條件和人類、鳥、昆蟲、線蟲等多種媒介從根際土壤定殖在寄主植物根內部，具有溶磷、產生植物激素、固氮、合成鐵載體、誘導植物產生抗性、產生抗真菌代謝產物等多種生物功能[3]。王娜等[6]將內生細菌接入棉花苗后再接種黃萎病菌，對黃萎病菌的防治效果可達79.52%～89.79%，有助于棉花病害的防治，為棉花增產提供有力幫助；杜曉寧等[7]研究表明枸杞可培養內生細菌遺傳多樣性豐富，對植物病原菌有較強的抑制活性；蔡學清等[8]得出內生細菌在寄主植物的定殖情況與其保鮮效果之間存在一定的正相關性，即內生定殖是其達到保鮮效應的機制之一。植物內生細菌也是重要的微生物農藥來源[9]，目前在生物防治中具有很大潛力，也作為增產菌或潛在的生防載體菌而加以利用。

線葉嵩草(Kobresiacapillifolia) 是高寒草地牧區的優勢牧草，不僅能適應惡劣的環境，還能為家畜提供優質的營養物質。崔月貞等[10]與高曉星等[11]對東祁連山牧草內生細菌研究表明，其具有溶磷、固氮、產吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)作用。本試驗對青藏高原青海省線葉嵩草中內生細菌的特性及其抗菌活性進行研究，以期其同樣具有溶磷、固氮、產IAA等能力，本研究以期明確青藏高原高寒草地線葉嵩草內生細菌的多樣性和生物功能，為合理利用極端生境牧草提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試菌株 線葉嵩草采于2016年8月37°4′8″ N，100°52′42″ E的青海省海晏縣青海湖鄉，并對其根部進行分離得到內生細菌。

1.1.2供試指示菌 馬鈴薯炭疽病菌(Colletotrlchumcoccodes)，馬鈴薯枯萎病菌(Fusarlumavenaceum)，馬鈴薯壞疽病菌(Phomafoveata)和番茄早疫病菌(Alternariasolani)，由甘肅農業大學植物保護學院植物病原細菌及細菌多樣性實驗室提供。

1.1.3供試培養基 肉汁胨培養基(nutrient Ager，NA)用于內生細菌分離、純化和保存等[12]；馬鈴薯葡萄糖培養基(potato Dextrose Agar，PDA)用于植物病原真菌的培養和對峙實驗[13]；金氏(King)培養基用于產IAA的試驗；Pikovaskaia培養基(pikovaskaia’s，PKO)和蒙金娜培養基(Mehknha)分別用于溶解無機磷和有機磷試驗[14]，阿須貝無氮培養基(Ashby)用于篩選固氮菌[15]。

1.2 方法

1.2.1內生細菌的分離純化 將線葉嵩草根部組織表面用清水清洗干凈，晾干后稱取2 g，表面消毒后置于無菌研缽中研碎，吸取植物組織研磨浸出液按10倍濃度梯度稀釋后，吸取0.1 mL涂布于NA培養基上，以最后一次洗滌水為對照，28℃培養3～7 d，根據菌落形態，顏色，大小，邊緣整齊度及表面形態等分類，純化后4℃保存備用[16]。

1.2.2生物功能測定

1.2.2.1 拮抗能力測定

采用平板對峙法測定抑菌效果[17-19]，用直徑5 mm的打孔器取指示菌菌塊于PDA平板中央，在指示菌四周3 cm處接種供試菌，4次重復，將馬鈴薯壞疽病菌放于15℃培養，其余3個指示菌放于28℃培養。以不接種供試內生菌為對照，待對照滿皿后測量菌落直徑，計算抑菌率[20]。

1.2.2.2 固氮能力測定

將純化得到的內生細菌接種于NA液體培養基中，置于搖床28℃、120 r·min-1震蕩培養24 h，取培養所得到的菌懸液0.1 mL接種于阿須貝無氮平板和液體培養基中，以無菌水為對照，3次重復，平板置于28℃培養箱培養，液體置于120 r·min-1震蕩培養，待第7天觀察，平板上有菌落或液體培養基變渾濁記為“+”，否則記為“-”。

1.2.2.3 溶磷能力測定

將活化的內生細菌涂布于PKO(無機磷)和蒙金娜(有機磷)培養基上，28℃培養14天后觀察解磷圈，3次重復，根據解磷圈與菌落直徑比值大小確定其溶磷能力。

1.2.2.4 產IAA能力測定

采用Salkowski比色法[21]，分別在100 mg·L-1含色氨酸和不含色氨酸的金氏培養液中接種0.1 mL菌懸液[13]，加等量無菌水為對照，置于28℃，120 r·min-1恒溫震蕩培養12 d，取50 μL菌懸液加入等量PC比色液，室溫靜置15 min后，觀察顯色反應，3次重復，全部變紅表明能產IAA，記為“+”，否則記為“-”。

1.2.3內生細菌的鑒定

1.2.3.1 培養性狀觀察

將內生細菌接種于NA培養基上，在28℃無光照條件下培養72 h，觀察內生細菌菌落形態特征并描述和照相。

1.2.3.2 形態觀察

內生細菌在NA平板上培養經18～24 h革蘭氏染色和鏡檢，觀察菌體顏色和形態，并顯微拍照。

1.2.3.3 16S rDNA鑒定

以10株內生細菌DNA為模板，使用細菌16S rRNA 基因通用引物進行擴增，擴增引物1為5'-CCG GAT CCA GAG TTT GAT CAT GGC TCA GCA-3'，引物2為5'-CGG GAT CCT ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3'，擴增體系包括25 μL 2×MasterMix，模板 2 μL，上下游引物各2 μL，ddH2O 19 μL，總體積50 μL，PCR程序為：94℃預變性 4 min， 94℃變性30 s， 60℃退火30 s， 72℃延伸90 s，30個循環，72℃延伸10 min。獲得特異片段送到武漢金開瑞生物工程有限公司測序，并將序列上傳至NCBI 進行BLAST比對分析(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。用Maga 6.0軟件構建系統發育樹，確定其系統發育學地位。

2 結果與分析

2.1 內生細菌的分離純化

根據菌落大小、顏色、形態挑取不同單菌落，純化后從線葉嵩草根部分離出10株內生細菌，分別編號為2G1、2G2、2G3、2G4、2G5、2G6、2G7、2G8、2G9和2G10保存備用。對照沒有細菌菌落長出，說明表面消毒徹底，所得細菌均為內生細菌。

2.2 生物功能測定

除2G1和2G10對4種指示菌均無拮抗作用外，其他8株內生細菌對4種指示菌均有拮抗作用，其中對馬鈴薯炭疽病菌的拮抗作用最強，最強菌株是2G6，抑菌率達 88.58%， 2G8抑菌率最弱，也達66.98%，都顯著高于對其他菌株的抑菌率(P<0.05)。8株內生細菌對番茄早疫病菌、馬鈴薯枯萎病菌和馬鈴薯壞疽病菌抑菌率介于32.59%～63.61%之間，其中2G5對番茄早疫病菌的抑菌率也較高為63.61%，(圖1，表1)。該結果表明，除2G1和2G10以外的8株內生細菌均具有抑菌能力，具有良好的生物防治應用潛力。

圖1 2G9的抑菌作用Fig.1 The antagonism effect of 2G9

10株內生細菌均能固氮，但無溶磷能力，2G1和2G10分泌IAA(表1)。該結果說明線葉嵩草根部內生細菌具有功能多樣性。

2.3 內生細菌的鑒定

2.3.1培養形狀觀察 從10株內生細菌培養性狀看線葉嵩草內生細菌在形態上存在多樣性(圖2)。

圖2 內生細菌培養性狀Fig.2 Endophytic bacteria culture traits

表1 線葉嵩草內生細菌的生物功能測定Table 1 Determination of biological functions of endophyte bacterium from Kobreais capillifolia

注：“+”：有功能；“-”無功能；同一行標不同字母表示在0.05水平差異顯著

Note: “+”:With biological function;“-”:Without biological function; Different lowercase letters within the same line mean significant difference among different treatments at the 0.05 level

2.3.2形態觀察 10株內生細菌均為革蘭氏陽性菌，且均為桿狀，菌體差別明顯，2G10菌體最長，達20.29 μm，2G1菌體最寬，為1.60 μm，其他菌株長和寬均介于這兩者之間(圖3，表2)，表現出明顯的形態多樣性。

圖3 內生細菌的革蘭氏染色Fig.3 Gram stain of endophytice bacteria from A.inebrians

表2 內生細菌形態特征Table 2 Morphological characteristics of endophytic bacteria

注：G+：革蘭氏陽性

Note: G+: Gram-positive bacteria

2.3.316S rDNA鑒定 所測序列與GenBank數據庫中序列比對和構建系統發育樹表明，10株內生細菌都屬于芽孢桿菌屬，2G1和2G10分別與芽孢桿菌屬的Bacillusthuringiensis(KT965084.1)、Bacillussubtilis(JX994100.1)和Bacillussimpix(KF818620.1)一致性在99%以上，并且在系統發育樹上聚在一起，初步將其分別鑒定為芽孢桿菌屬的Bacillusthuringiensis和Bacillussimpix，2G2和2G9分別與Bacillusmethylotrophicus(KU877329.1、KM817258.1)的一致性在99%以上，在系統發育樹上聚在一起，初步鑒定為Bacillusmethylotrophicus，2G3和2G6分別與Bacillusamyloliquefaciens(KU321524.1)的一致性在99%以上，并在系統發育樹上聚在一起，初步鑒定為Bacillusamyloliquefaciens，2G4和2G5分別與Bacillussiamensis(KC851838.1)的一致性達99%，并且在系統發育樹上聚在一起，初步鑒定為Bacillussiamensis，2G7和2G8分別Bacillussubtilis.(KU551205.1、KU5563 29.1)一致性達99%以上，并且在系統發育樹上聚在一起，初步鑒定為Bacillussubtilis(圖3)。結合前文中的培養性狀和形態特征測定，將10株內生細菌分屬于1個屬6個種，得出線葉嵩草根部內生細菌在屬的種類上比較單一，但在種的水平上有很大差別。

3討論與結論

廣泛分布于青藏高原的高山草甸對密集放牧非常寬容，這些草地中的植物群落目前正在從莎草科向禾本科物種轉變，因此，正在進行的植物群落禾草替代將減少青藏高原矮嵩草甸[22]，減少青藏高原菌種資源。植物內生菌的生境特殊性決定了其既有理論研究的廣度和深度，又有廣泛的應用潛力，是潛力巨大且尚待開發的微生物新資源[23]。Forchetti等[24]和Zhang等[25]認為具有固氮和分泌IAA能力的植物內生細菌開發為生物菌肥有優勢，本試驗分離得到的2G1和2G10同時具有固氮和分泌IAA的能力，能夠作為生物菌肥開發。崔月貞等[10]得出高寒草地優勢牧草組織內具有豐富的可分泌IAA的內生細菌,且其中分泌IAA能力較強的菌株主要分布于線葉嵩草葉部和生長期的根部，但本試驗分離出的內生細菌僅有2株具分泌IAA的能力，可能與不同地區線葉嵩草內生細菌的差異有關，但具體原因仍要進一步研究。

馬鈴薯是我國較為重要的糧飼兼用作物，但是近年來報道的馬鈴薯病害日趨嚴重[26],本試驗分離所得內生細菌除2G1和2G10以外，其余8株內生細菌對馬鈴薯壞疽病菌、馬鈴薯炭疽病菌、馬鈴薯枯萎病菌和番茄早疫病菌都有較好的抑制作用，其中對馬鈴薯炭疽病的抑制效果最強，抑菌率分別為84.88%、84.57%、83.64%、85.80%、88.58%、86.11%、66.98%和82.41%，比崔月貞等[19]報道的最強抑菌率70.25%平均高13.07%，在馬鈴薯病害防治中展現出了巨大開發為生物制劑的潛力，為該菌能夠更好的在大田中防治馬鈴薯炭疽病，還需進一步研究其抑菌機制及發酵條件優化等。此外本試驗還發現2G2、2G3、2G4、2G5、2G6、2G7、2G8和2G9具有固氮能力，該研究結果為開發藥肥兼用的微生物產品提供了菌種資源。

利用16S rDNA序列分析方法對內生細菌進行鑒定得出，分離所得10株內生細菌均為芽孢桿菌屬，與張芳芳等[27]研究所得結果芽孢桿菌屬是分離頻率最高的菌種相似。試驗中分離菌株均為芽孢桿菌屬的原因可能在于青海溫度低，其它菌株可能不能越冬，而芽孢桿菌抗逆能力強。此外本試驗僅利用16S rDNA序列分析方法對內生細菌進行了鑒定，還需利用生理生化試驗及(G+C)%等進一步鑒定。