6種高寒牧區禾本科牧草抗旱性研究與評價

李京蓉， ， ， ， ， ， ，， ， ， ，5，

(1. 青海師范大學， 青海 西寧810008； 2. 中國科學院西北高原生物研究所青海省寒區恢復生態學重點實驗室，青海 西寧810001； 3. 青海大學省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室， 青海 西寧810016；4. 天水師范學院甘肅省農業固體廢棄物資源化利用重點實驗室， 甘肅 天水741000； 5. 中國科學院大學， 北京100049； 6. 青海省水文水資源勘測局，青海 西寧 810001 )

中國有廣袤的疆土和復雜的地形，干旱和半干旱地區主要集中在華北、東北和西北地區[1]。各地環境中都各具特色。當植物遭遇不良環境(如高低溫、干旱、鹽),則發生一系列的生理生化代謝反應,表現為可逆抑制植物的代謝和生長,在嚴重的情況下甚至會造成不可挽回的傷害,導致整個植物的死亡, 給農業和畜牧業的生產帶來不可估量的損失[2]。

青海省位于青藏高原東北方向，天然草地資源十分豐富。而青海省內幾乎無良好的飼料資源，優質的飼草供應已成為制約該牧區畜牧業發展的障礙。一些地方采用了開發利用當地野生種質資源的方法來解決這一矛盾，更多的是從外地或國外采購的解決方案來滿足這種需求，但是引進品種不適合在當地惡劣的自然條件下耕作。若要長期穩定地解決種源問題，尋找高產優質飼草種源以治理生態環境和改良退化草地已迫在眉睫[3-4]。

本試驗選取的六種草種為多年生禾本科牧草。多生長于海拔3000～3600m以上的天然草地，是很多地區草地改良和人工草地建設的優良牧草，還是退耕還林、水土保持的重要牧草。然而，這些優良牧草目前仍處于試驗階段，還未大規模種植并應用于草地恢復與畜牧業發展中。

研究表明，干旱脅迫會造成植物生理脫水，導致細胞和組織的水勢下降，從而影響植物的各項生理生化反應過程[5]。同時，干旱脅迫還會破壞線粒體、葉綠體及其核結構的功能，影響光合作用和呼吸作用[6]。此外，青海特殊的地理位置及氣候，容易發生春旱等干旱脅迫會影響種子萌發時的吸水量，造成萌發不穩定，萌發率低，并且影響出苗率，嚴重時會完全抑制種子萌發[7-8]，也會導致植物細胞膨壓降低，從而阻礙植物生長[9]。

張美俊[10]、石永紅[11]等試驗表明丙二醛(malondialdehyde, MDA) 、可溶性糖含量及葉綠素含量能夠作為評價植物抗旱性的指標。因此，本試驗通過探究這六種牧草在萌發期，主要是苗期對干旱的生理響應，綜合評價它們的抗旱性強弱，為草甸恢復提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗選取了在青海省分布較為廣泛的6種禾本科牧草進行抗旱性評價(見表1)。

表1 供試材料Table 1 Test materials

1.2 試驗材料處理方法

1.2.1牧草萌發期試驗材料處理方法 水分脅迫條件由聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)溶液產生。共設6種處理，即PEG 質量濃度分別為0%(CK,蒸餾水)、5%、10%、15%、20%、25%。選擇成熟、飽滿、中等大小、均勻、無病的健康種子作為萌發材料。每粒試驗種子用1% NaCl 消毒15分鐘，用蒸餾水清洗干凈并放入鋪有濾紙的培養皿中，加入適量的PEG溶液，使其發芽。培養皿放置在培養箱中,溫度控制在20℃左右,每天大約12 h光照。每天給培養皿加等量的 PEG 溶液，濾紙浸透，少許剩余，每4天更換一次濾紙，以減少水勢變化。對照(CK)以蒸餾水代替 PEG 。每個濃度梯度4個重復(包括對照)，每個重復50粒種子。從觀察的日期起，從種子置于培養皿開始，胚芽長度為種子長度的1/2作為萌發的標準。將重復中最早有一粒發芽的日期作為開始，之后每天記錄發芽種子的數量，當連續12天每個培養皿都不再有種子萌發時將其作為發芽的結束期[12-14]。

發芽率(%) =(發芽數/供試種子數)×100%。

1.2.2牧草苗期試驗材料處理方法 選擇土壤需篩分除石去雜質，土壤:細砂:生物肥料的比例為4:1:1，入盆澆透，然后用1%NaCl 消毒的種子均勻地撒在盆中，播種深度1 cm，再輕輕的用干土覆蓋。播種后，將花盆放置在露天的室外環境中(避免雨水)，直到幼苗長到2～3片葉時開始間苗，每盆留30株。每種牧草6盆，共計36盆。生長到4～5片葉片時進行處理。設置干旱脅迫處理和對照(正常澆水)兩組。所有材料都是實驗前3 d澆水以使每盆土壤處于飽和含水狀態與正常澆水(土壤含水量保持在22.78±2.01%)作為對照。樣品分別于第0 d、第4 d、第8 d、第12 d和第16 d早上7:00-8:30 am(8:30-9:00 am)采樣，選用長勢一致、外觀大小相似的葉片，樣品用塑料包裝后，用保鮮膜包裹置于實驗室的冰箱中，并及時測定各項生理指標。

1.3 測定指標及方法

1.3.1相對含水量 取樣稱重后立即浸入水中后數小時，吸干水分，立即稱重；再次浸泡在水中一段時間，吸干水分，然后稱重，直到兩次稱重的結果基本一致，即新鮮的葉重(Wt)，放在烘箱中烘干至恒重，稱干重(Wd)。按下式計算：

葉片相對含水量(%)= 100%×[(Wf-Wd)/(Wt-Wd)]

1.3.2MDA含量和可溶性糖含量 MDA 含量和可溶性糖含量采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA) 比色法測定，采用雙組分分光光度計法可同時測定出可溶性糖的含量[15]。取上述酶提取液1.5 ml，加入2.5 ml 0.6%的TBA 溶液，混勻于沸水浴中反應15 min，迅速冷卻后4℃下離心10 min，取上清液測定450、532和600 nm下的吸光度[16]。

1.3.3葉綠素相對含量 稱取剪碎的鮮樣，于研缽中研成勻漿，加80%丙酮，繼續磨至組織變白，再過濾至25 ml容量瓶中，反復用丙酮清洗數次，最后用丙酮定容至25 ml。以80%丙酮為空白對照，測定470 nm、646 nm、663 nm波長下的吸光值。

Ca=12.21D663-2.81D646；

Cb=20.13D646-5.03D663；

葉綠素總濃度C=Ca+Cb；

Cx.c=(1000D470-3.27Ca-104Cb)/229；

Ca、Cb，葉綠素a和葉綠素b的濃度；Cx.c，類胡蘿卜素的總濃度。

根據下式計算組織中各色素的含量：

色素含量(mg/g)=[色素濃度C(mg/ml)×提取液總量(ml)×稀釋倍數×1000]/樣品葉片鮮重(g)。

1.4 綜合評價方法

應用Fuzzy數學中隸屬函數法[17-20]進行綜合評判，其計算公式如下:

(1) 與抗旱性呈正相關的參數采用公式:

U(Xijk)=Xijk-Xmin/Xmax-Xmin

(2) 與抗旱性呈負相關的參數采用公式:

U(Xijk)=1-Xijk-Xmin/Xmax-Xmin

式中，U( Xijk ) 為第i 個草種第j 個干旱天數第k 項指標的隸屬度，且U( Xijk )∈[0，1]; Xijk表示第i個草種第j個干旱天數第k個指標測定值; Xmax、Xmin為所有參試種中第k 項指標的最大值和最小值。

1.5 數據分析

試驗數據處理采用Excel 2007、SPSS 20.0 分析試驗數據和Orgin 程序繪圖，試驗數據處理了相同物種和不同 PEG 濃度間以及相同 PEG 濃度下不同物種之間的差異，用 SNK 方法在0.05顯著水平上做多重比較[2]。

2 結果與分析

2.1 PEG對禾本科牧草萌發期抗旱性影響

從圖1可以看出，種子萌發后對水分脅迫具有較強的適應性。用不同濃度的PEG溶液處理試驗種子，當 PEG 濃度低(5% PEG) 時，有效促進種子萌發，6種牧草發芽率相比對照均有所增加；另外，除在0%和10%PEG 濃度時各品種發芽率相近外，15%～25% PEG 濃度下的6種禾本科牧草種子的發芽率隨 PEG 濃度的增加呈顯著降低趨勢(P<0.05)。由圖可知，6種牧草發芽率大小順序為：草原看麥娘>無芒雀麥>同德短芒披堿草>同德貧花鵝觀草>大穎草>扁穗冰草。

圖1 不同PEG濃度處理下發芽率Fig.1 Relative germination rate of six grasses under different PEG concentrations treatment注：小寫字母表示同一物種濃度間差異，大寫字母表示同一濃度下物種間差異Note: Lowercase letters indicate difference in concentrations of the same species, and capital letters indicate difference between species at the same concentration

2.2 干旱脅迫對禾本科牧草苗期各生理指標影響

圖2可知，各牧草葉片相對含水量與對照(土壤含水量保持在22.78±2.01%)相比變化不大，而各牧草相對含水量均隨干旱天數增加而呈現明顯的下降趨勢。不同牧草間比較，對照、4 d與8 d時，各品種相對含水量變化不大，但第12 d、16 d時，各品種間相對含水量存在顯著差異，下降速度依次是大穎草>扁穗冰草>同德貧花鵝觀草>同德短芒披堿草>草原看麥娘>無芒雀麥。

圖2 干旱脅迫對相對含水量的影響Fig.2 Effect of Drought Stress on Relative Water Content

圖3 干旱脅迫對丙二醛含量的影響Fig.3 Effect of Drought Stress on Malondialdehyde Content

由圖3可知，丙二醛含量隨干旱脅迫程度的增強而呈整體上升趨勢。在12 d和16 d，大穎草、扁穗冰草 MDA 增加最多，分別比對照增加了9.14，12.31倍和9.31，12.78倍；MDA 增加最少的為草原看麥娘和無芒雀麥，分別為對照的5.84，8.77倍和5.71，8.52倍；同德短芒披堿草和同德貧花鵝觀草的增量則居中，分別是對照的7.84，11.82倍和8.39，12.14倍。表明大穎草、扁穗冰草受害最大，草原看麥娘、無芒雀麥受害則最小。

可溶性糖含量在圖4中呈先升高后降低的趨勢。在8 d時，可溶性糖含量最高，并自此開始下降。其中，大穎草、扁穗冰草分別比對照下降了1.53和2.82倍，相比其他物種可溶性糖含有量最少，抗旱能力相對其他牧草較弱。

圖4 干旱脅迫對可溶性糖含量的影響Fig.4 Effect of Drought Stress on Soluble Sugar Content

葉綠素含量由圖5可知，在第0～4 d，各牧草葉綠素均呈現顯著增加的趨勢(P<0.05)，但從第8～16 d開始，各牧草葉綠素含量隨干旱天數的增加呈現下降趨勢，且各品種間存在顯著差異(P<0.05)。

圖5 干旱脅迫對葉綠素含量的影響Fig.5 Effects of Drought Stress on Chlorophyll Content注：小寫字母表示同一物種濃度間差異，大寫字母表示同一濃度下物種間差異Note: Lowercase letters indicate difference in concentrations of the same species, and capital letters indicate difference between species at the same concentration

2.3 禾本科牧草抗旱性綜合評價

將參試的6種牧草與各項生理指標進行綜合分析，計算6種牧草各指標隸屬度值，并以各牧草的平均抗旱隸屬度作為鑒定抗旱性強弱的綜合評價指標。根據6種牧草的抗旱性指標隸屬函數值及抗旱能力大小(表2)，六種牧草的隸屬函數值平均數大小依次為：草原看麥娘>無芒雀麥>同德短芒披堿草>同德貧花鵝觀草>大穎草>扁穗冰草。

表2 各牧草對干旱脅迫適應指標的隸屬函數值及評價Table 2 Membership value and evaluation of adaptation indexes of herbage to drought stress

3 討論

抗旱性是受多種因素影響的一種復雜的定量性狀。一個物種在所有性狀上都不會特別顯著。因此，孤立的用單一指標評定牧草的抗旱性是片面的，得出的結果可能并不能準確的代表牧草的實際抗旱能力。因此，為了反映植物抗旱性，在評價植物抗旱時，應利用多種指標對牧草抗旱性進行綜合評價，并結合實際生長情況進行綜合評價。此外，牧草干旱脅迫下的抗旱性機制及其改善方法還有待進一步研究[21-23]，以取得準確可靠的結果。

水分是種子萌發的必要條件之一。抗旱性強的牧草具有較高的萌發率以及抗旱性弱的牧草具有較低的萌發率。而Blum[24]與Sharma[25]認為，水分脅迫下植物種子的萌發率和抗旱性并不是呈正相關關系，甚至是負相關的。在研究牧草種子萌發特性及其抗旱性差異時，不同濃度的PEG溶液一般被用作滲透脅迫因子，模擬土壤自然水勢，在水分脅迫下對牧草種子萌發進行處理。目前，關于豆科植物的研究較多[22,26-27]和Agropyron vristatum[5,28]。結果表明，PEG脅迫下種子萌發率可以作為這些牧草抗旱性能的評定指標。本研究對六種禾本科牧草發芽率的結果分析與前面的研究保持一致。

葉綠素是一種植物合成有機色素、進行光合作用的物質，外部的環境情況會影響它的合成與降解，以此反映牧草對外界脅迫的應對能力。干旱脅迫情況下，葉綠素含量在初始的前幾天有所升高，之后會逐漸降低。有研究表明抗旱性強的牧草的葉綠素含量高于抗旱性弱的牧草的葉綠素含量[29-31]。其原因可能是由于葉綠素生物合成作用減弱引起的水分的急劇減少；另一方面，由于干旱引起植物中活性氧的積累，氧自由基的積累直接或間接活化膜脂質過氧化，造成膜滲透性損傷，加速葉綠素分解[30]。結果表明，在干旱脅迫下6種禾本科草葉綠素的變化趨勢與黃華等[32]、張曉海等[33]的結果一致,在第0～4 d，各牧草葉綠素均呈現顯著增加的趨勢，而從第8～16 d開始，各牧草葉綠素含量隨干旱天數的增加呈現下降趨勢，且各品種間存在顯著差異。本試驗中葉綠素含量的大小順序為:草原看麥娘>無芒雀麥>同德短芒披堿草>同德貧花鵝觀草>大穎草>扁穗冰草。

干旱脅迫下植株體表首先體現出植株慢慢發黃，體內表現為葉片含水量下降。試驗表明，干旱脅迫下6種禾本科牧草葉片相對含水量均隨干旱脅迫時間的增長而呈顯著下降趨勢，這與前人的研究結果一致[27,34-35]。所得出相對含水量的大小順序依次是：草原看麥娘>無芒雀麥>同德貧花鵝觀草>同德短芒披堿草>大穎草>扁穗冰草。

干旱脅迫使牧草生物膜的結構和功能受到一定程度的損害，隨著干旱時間的增長，生物膜所受損害程度逐漸加深，影響植物體內一系列的生理生化代謝反應。抗旱性強弱的指標MDA是細胞膜過氧化的終產物，丙二醛含量一般情況下可代表細胞膜的傷害程度[36]。結果表明，隨著水分脅迫時間的延長，丙二醛含量在12～16 d期間顯著增加，研究結果與辛國榮等[37-38]的結果一致，但也有人[39]認為抗旱性強的品種的MDA含量相較于不抗旱品種反而增加較多。這種現象可能是在干旱脅迫下不同品種的丙二醛對此脅迫的敏感度存在差異，因此導致調節程度的不同。本試驗中丙二醛含量的大小順序是：無芒雀麥>草原看麥娘>同德短芒披堿草>同德貧花鵝觀草>大穎草>扁穗冰草。

在干旱脅迫下，一些可溶性物質在植物體內會自發的迅速積累，以降低其體內滲透潛力，從而保證干旱脅迫下植物的正常供水量。其中，可溶性糖是植物體細胞內的主要滲透調節物，可溶性糖含量的多少直接體現出細胞受到的干旱脅迫強度，也可判定植物對逆境脅迫的抵抗力[40-41]。試驗表明，6種禾本科牧草在第8 d前可溶性糖迅速積累，當干旱脅迫持續到12 d時，各禾本科牧草的可溶性糖含量都有所降低，但相較于對照仍呈上升趨勢，直到16 d時，與對照沒有顯著的差異。

本研究以6種高寒地區的禾本科牧草為研究對象，選擇種子萌發期和幼苗期兩個對水分最為敏感的時期進行了抗旱性試驗并測定相關生理生化指標。試驗通過人工模擬牧草的逆境生長環境，但這與牧草的實際生長逆境條件仍存在很大差別。因此，取得的所有實驗數據還有待于到實踐中去檢驗。本試驗僅對幼苗的抗旱性能做了研究,對干旱脅迫下6種禾本科牧草的水分臨界期以及其他指標的影響還有待于進一步研究。以后的研究如果能與實際環境條件和生產實際相結合，使篩選出的抗旱性強的高寒草甸優良牧草服務于實際生產需要并有效促進畜牧業的發展。

4 結論

本文選擇了六種禾本科牧草，進行種子萌發期以及幼苗期抗旱性研究。可知，從種子萌發期抗旱性結果表明，PEG 濃度在5%時促進種子萌發，較高PEG 濃度(15%～25%)顯著抑制種子發芽率。通過對萌發期發芽率和苗期各生理指標進行隸屬綜合值評價得出，6種牧草抗旱性強弱為：草原看麥娘>無芒雀麥>同德短芒披堿草>同德貧花鵝觀草>大穎草>扁穗冰草。