響應面法優化云南宣木瓜齊墩果酸和熊果酸的提取工藝研究

羅小芳，郭乙穎，胡柳，王釵，宋艷芝，李治章，2，王宗成，*

（1.湖南科技學院化學與生物工程學院，湖南永州425199；2.湖南科技學院湖南省銀杏工程技術研究中心，湖南永州425199；3.湖南科技學院湘南優勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室，湖南永州425199）

宣木瓜是薔薇科木瓜屬植物，是集藥用食用的植物，主要產于安徽，四川，云南，湖北等地，種植面積廣泛，木瓜色香味俱佳，有“嶺南果王”之稱。藥典記載：宣木瓜性溫、味酸澀，有舒筋活絡、祛風濕痹等癥[1-2]。木瓜中含有多種氨基酸和營養物質，而且還含有多種活性物質，如齊敦果酸、熊果酸具有抗癌、提高免疫力降血脂、降血糖的功效[3]。我國目前宣木瓜用量不大，大多宣木瓜腐爛丟棄，造成不小的浪費，因此從木瓜中提取齊敦果酸和熊果酸對于開發木瓜的藥用價值，以及其副產物的綜合利用有重要的意義。

齊墩果酸和熊果酸是互為同分異構體的兩種五環三萜類脂溶性化合物[4]，目前齊墩果酸與熊果酸的提取方法主要有回流提取法、超聲輔助法和微波輔助提取法等[5]。超聲波提取技術屬新興的生物提取技術，工作原理是利用超聲波的機械效應，空化效應和熱效應，通過增大介質分子的運動速度、介質的穿透力提取生物有效成分，具有操作簡便、提取效率高、有效成分不被破壞等優點[6-9]。本試驗研究以超聲波輔助快速提取宣木瓜中的齊墩果酸和熊果酸，根據Box-Benhnken中心組合試驗設計原理[10-12]，用響應面分析法對提取工藝進行優化，旨在為工業化提取齊墩果酸和熊果酸提供理論依據。

1 儀器與材料

FV-SV-360超聲細胞破碎儀：寧波新芝儀器有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀：日本島津；JFSD-100粉碎機：江陰市豐華藥化機械有限公司；YP1200分析天平：奧豪斯國際貿易（上海）有限公司；WG-71新型電熱恒溫鼓風干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司。

宣木瓜：采買自云南大理，清洗干凈，去籽切片，并放在恒溫干燥箱中干燥，干燥后粉碎過40目篩；齊墩果酸標準品、熊果酸標準品：上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：德國默克；無水乙醇、乙酸銨（均為分析純）：天津市福晨化學試劑廠。

2 方法

2.1 齊墩果酸和熊果酸的提取工藝

宣木瓜→干燥→粉碎→過篩40目→精密稱取干燥、粉碎、過篩的宣木瓜→置于燒杯內→按單因素控制試驗條件→稱重→置于超聲波細胞粉碎儀中提取→補失重→過微濾膜→取續濾液→供試品溶液→按藥典方法進行檢測

2.2 高效液相色譜分析方法[13]

2.2.1 齊墩果酸和熊果酸含量測定的液相條件

色譜柱：島津 C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：乙腈-10 mmol/L乙酸銨水溶液（80∶20，體積比）；流速：0.8 mL/min；柱溫：18℃；檢測波長：210 nm。

2.2.2 標準曲線的制作

2.2.2.1 齊墩果酸的標準曲線的制作

準確稱取齊墩果酸標準品11.0 mg，用甲醇溶液溶解，并定容至 10 mL。分別精密吸取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇溶液稀釋至刻度，分別進樣 10 μL。以進樣量（μg）為橫坐標，峰面積積分值（y）為縱坐標繪制標準曲線，并進行線性回歸，得到線性回歸方程。

2.2.2.2 熊果酸的標準曲線的制作

準確稱取熊果酸標準品10.9 mg，用甲醇溶液溶解，并定容至 10 mL。分別精密吸取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇溶液稀釋至刻度，分別進樣 10 μL。以進樣量（μg）為橫坐標，峰面積積分值（y）為縱坐標繪制標準曲線，并進行線性回歸，得到線性回歸方程。

3 結果與討論

3.1 齊墩果酸和熊果酸的標準曲線

以齊墩果酸和熊果酸的質量（μg）為橫坐標，色譜峰面積（mAU·s）為縱座標，繪制標準曲線（圖1～圖2），并進行線性回歸，得到線性回歸方程。

齊墩果酸 y=493 101x+2 553.4（R2=0.999 9），表明齊墩果酸在0.06 μg～0.39 μg范圍內線性關系良好。熊果酸 y=569 380x-4 920（R2=0.999 8），結果表明，熊果酸在 0.11 μg～0.76 μg范圍內線性關系良好。

圖1 齊墩果酸標準曲線Fig.1 Standard curve of oleanolic acid

圖2 熊果酸標準曲線Fig.2 Standard curve of ursolic acid

圖3 乙醇濃度、液料比、超聲功率及超聲時間對齊墩果酸和熊果酸提取效果的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration，liquid-to-solid ratio，ultrasonic power and ultrasonic time on the yield of oleanolic acid and ursolic acid

3.2 單因素試驗及結果

乙醇濃度、液料比、超聲功率及超聲時間對齊墩果酸和熊果酸提取效果的影響見圖3。

3.2.1 乙醇濃度對提取效果的影響

固定超聲破碎提取時間 3 min，液料比 20∶1（mL/g）與超聲功率480 W，考察不同乙醇濃度對齊墩果酸與熊果酸提取得率的影響（見圖3A）。由圖3A可知，乙醇濃度為60%～90%時，齊墩果酸與熊果酸的提取得率都隨乙醇濃度的提高而增加。乙醇濃度為90%時，二者的提取得率最高，繼續增加乙醇濃度，其提取得率幾乎沒有變化。齊墩果酸與熊果酸均溶于乙醇，不溶于水，兩者隨乙醇濃度的提高，溶解度相應增大，提取得率也隨之提高[8]。因此，中心組合試驗選取乙醇的體積分數范圍為80%～100%。

3.2.2 液料比對提取效果的影響

固定乙醇體積分數90%，超聲提取時間3 min與超聲功率480 W，考察不同液料比對齊墩果酸與熊果酸提取得率的影響（見圖3B）。圖3B可以看出，當液料比從 10∶1（mL/g）增加至 20∶1（mL/g）時，齊墩果酸與熊果酸提得率均相應的提高，繼續增加液料比，齊墩果酸與熊果酸提取得率變化不明顯。增大液料比可以提高有效成分的擴散速度，有助于齊墩果酸與熊果酸從基質中溶出，考慮到提取液濃縮所需的能耗，中心組合試驗選擇液料比為 20∶1（mL/g）。

3.2.3 超聲功率對提取效果的影響

固定乙醇體積分數 90%，液料比 20∶1（mL/g）與超聲提取時間3 min，考察不同超聲功率對齊墩果酸與熊果酸提取得率的影響（見圖3C）。圖3C可以看出，當超聲功率從240 W增加至480 W時，齊墩果酸與熊果酸提得率均相應的提高，繼續增加超聲功率，齊墩果酸與熊果酸提取得率反而有所下降。增大超聲功率可以提高植物細胞的破碎度，有助于齊墩果酸與熊果酸從基質中溶出，但超聲功率過高會破壞齊墩果酸與熊果酸的結構，降低提取得率。因此中心組合試驗選擇超聲功率的范圍為360 W～600 W。

3.2.4 超聲時間對提取率的影響

固定乙醇濃度 90%，液料比 20∶1（mL/g）與超聲功率480 W，考察不同超聲提取時間對齊墩果酸與熊果酸提得率的影響（見圖3D）。由圖3D可知，隨著超聲提取時間的延長，空化效應產生大量的新生表面，提取液的溫度升高，加速了有效成分的溶解與擴散，提取得率逐漸提高；當時間達到3 min時，齊墩果酸與熊果酸的提取得率均為最高，說明此時已達到提取平衡[12]。此后再延長時間，齊墩果酸與熊果酸的提取得率變化不明顯。因此，中心組合試驗選擇提取時間的范圍為 2 min～3 min。

3.3 響應面分析試驗及結果

3.31 響應面分析試驗設計

綜合單因素試驗結果，液料比對齊墩果酸與熊果酸的提取得率影響較小，因此固定液料比為20∶1（mL/g），然后根據Box-Benhnken中心組合試驗設計原理，選取乙醇濃度、超聲功率、超聲時間3個因素為自變量，齊墩果酸和熊果酸相加的總得率為響應值，設計三因素三水平的二次回歸方程來擬合自變量與總得率之間的函數關系，采用響應面分析方法優化提取工藝。各因素水平及編碼見表1。

表1 響應面分析因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

3.3.2 響應面試驗結果分析

以 A（乙醇濃度）、B（超聲功率）、C（超聲時間）為自變量，以齊墩果酸和熊果酸的總得率為響應值（Y），進行響應面分析試驗，試驗結果見表2，并利用軟件對結果進行回歸分析，結果見表3。

表2 響應面試驗設計方案及結果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

表3 響應面設計回歸方程的方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

表2中共有17個試驗組合，1～12為分析因試驗，13～17為零點試驗。采用Design Expert8.0.6軟件對試驗數據進行分析，由此可求出影響因素的一次項、二次項及其交互項的關聯方程為：齊墩果酸和熊果酸的總得率=3.85＋0.27A＋0.11B＋0.35C－0.10AB－0.21AC－0.13BC－0.16A2－0.043B2－0.15C2。

對回歸方程進行方差分析，結果見由表3，可知超聲時間、超聲功率、乙醇濃度3個因素對齊墩果酸和熊果酸提取總得率的影響順序為：超聲時間＞乙醇濃度＞超聲功率。且3個因素對齊墩果酸和熊果酸提取總得率影響極顯著；超聲時間和乙醇濃度二次項對齊墩果酸和熊果酸提取總得率的影響均達到極顯著水平；交互項對得率的影響均達到顯著水平。模型回歸P值＜0.000 1差異極顯著，失擬項P值=0.183 8>0.05，又有模擬決定系數R2=0.991 6，說明該模型齊墩果酸和熊果酸總得率的變化99.16%來自所選因變量，且與實際情況擬合很好，能夠正確反應齊墩果酸和熊果酸得率與超聲時間、乙醇濃度及超聲功率之間的關系。因此，可用該模型對齊墩果酸和熊果酸的最佳試驗工藝進行分析和預測。

3.2.4 響應面曲面分析

響應面圖是響應值Y與對應的試驗因素A、B、C構成的三維空間的曲面圖及其在二維平面上的等高圖，將一個因素固定在零水平，對另外兩個因素進行分析，從中可以直觀地反映各因素及其交互作用對響應值的影響，利用Design Expert軟件作出響應曲面及等高線圖。各因素交互作用響應面和等高線圖如圖4。

圖4比較可知，超聲時間對齊墩果酸和熊果酸提取的總得率的影響曲線相對較陡，影響最為顯著；其次是乙醇濃度，而超聲功率對齊墩果酸和熊果酸提取的總得率的影響曲線相對平滑，影響較小。

由軟件分析可得，提取齊墩果酸和熊果酸的最優工藝條件為：乙醇濃度95.56%，超聲時間3.79 min、超聲功率440 W，在此條件下，齊墩果酸和熊果酸的理論得率為4.05 mg/g。

圖4 各提取因素之間的交互作用影響Fig.4 Response surface plots showing the mutual effects of different factors on the yield of total yield of oleanolic acid and ursolic acid

3.4 驗證試驗

為了檢驗試驗結果與真實情況是否一致，根據上述分析結果進行驗證試驗，考慮到實際操作情況，確定提取齊墩果酸和熊果酸的最優工藝條件為：乙醇濃度95%，超聲時間3.8 min、超聲功率440 W，在此條件下進行6次平行試驗，齊墩果酸和熊果酸提取的總得率4.03 mg/g；與理論預測值接近。因此，響應面法優化所得的超聲輔助提取條件參數準確可靠，具有一定的實用價值。

4 結論

采用超聲輔助提取宣木瓜中的齊墩果酸和熊果酸，通過單因素試驗和Box-Behnken試驗設計及響應面分析對提取齊墩果酸和熊果酸的工藝進行優化，得到齊墩果酸和熊果酸的最佳工藝條件為：乙醇濃度95%，超聲時間3.8 min、超聲功率440 W，測得的齊墩果酸和熊果酸的實際總得率為4.03 mg/g，與理論基本相符。