AB-8大孔樹脂對艾草黃酮動態吸附工藝的研究

（南陽理工學院生化學院，河南省工業微生物資源與發酵技術重點實驗室，河南南陽473004）

艾草（Artemisia argyi），又稱香艾，為菊科草本植物，適宜生長在溫帶地區，我國大部分地區均有生長，主要產于山東、安徽、河北、河南、湖北等省[1-5]。近年研究發現，艾草中含有的黃酮類化合物，具有降血脂、降血壓、抗血栓、抗腫瘤、抗氧化、增強免疫力、延緩衰老以及治療慢性前列腺炎等多種生理活性。艾草作為黃酮類化合物的天然載體，具有廣闊的開發應用前景[6-13]。

AB-8大孔樹脂對艾草黃酮動態吸附的因素與吸附率之間的關系具有非線性特征。利用反向傳播（back propagation，BP）神經網絡可對非線性數據進行有效的分析處理，使非線性關系的輸入量與輸出量具有關聯性，但在實際應用中存在網絡全局搜索能力不足、易陷入局部最優等缺陷[14-17]。遺傳算法是一種概率搜索算法，它的基本思想是通過全面模擬自然選擇和遺傳機制，通過對種群個體的選擇、雜交和變異，形成一種具有“生產+檢驗”特征的搜索算法，該法具有全局最優的特點，且能優化BP神經網絡的連接權值，可很好地克服BP神經網絡陷入局部最優的缺陷，從而對形式未知的函數求出最優解[18-22]。

本文在單因素試驗基礎上，利用Box-Behnken試驗的數據，采用BP神經網絡建立AB-8大孔樹脂對艾草黃酮動態吸附過程的數學模型，利用遺傳算法對所建立的BP神經網絡進行全局尋優，根據實際操作情況，將遺傳算法全局尋優結果進行適當修正，確定AB-8大孔樹脂對艾草黃酮動態吸附的最優工藝，以期為艾草黃酮進一步的生理活性研究奠定基礎。

1 材料

1.1 原料

艾草：南陽市張仲景藥材市場，清洗，晾干，粉碎，備用。

1.2 試劑

蘆丁：中國藥品生物制品檢定所；氯仿、正丁醇、乙醇：天津科密歐化學試劑有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、硝酸鋁、亞硝酸鈉：國藥集團化學試劑有限公司。以上試劑均為國產分析純。

1.3 主要儀器設備

FW-100高速萬能粉碎機、101-2A電熱鼓風干燥箱：北京中興偉業儀器有限公司；FA1004精密電子分析天平：上海天平儀器廠；R-205旋轉蒸發儀：無錫申科儀器有限公司；PHS-3C精密pH計、752N紫外-可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；TDL-40B臺式高速離心機：上海安亭科學儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵：鞏義市予華儀器有限公司；HWS-24電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；300 mm×16 mm層析柱：上海摩速科學器材有限公司。

2 方法

2.1 艾草黃酮粗提液的制備

準確稱取20 g艾草粉置于1 000 mL三角瓶中，按照料液比1∶25（g/mL）的比例加入70%乙醇，置于60℃、120 r/min的恒溫水浴振蕩器內恒溫振蕩2 h，抽濾，濾液進行真空濃縮，至沒有醇味。

2.2 Sevage法脫蛋白

量取適量艾草黃酮濃縮液于分液漏斗中，加入等體積的Sevage試劑（氯仿∶正丁醇體積比為5∶1）劇烈振蕩20 min，靜置，去除蛋白層和有機溶劑層，取上清夜，反復多次操作，脫蛋白后的濃縮液置于-4℃冰箱中保存備用。

2.3 黃酮類化合物的測定

黃酮類化合物在亞硝酸鹽作用下，與Al（NO3）3發生絡合反應生成黃色鋁絡合物，在堿性條件下顯紅色，507 nm波長下有最大吸收[23]，因此可采用NaNO2-Al（NO3）3顯色法，以蘆丁作為標準品制作標準曲線，以507 nm作為檢測波長測定吸光值，對比蘆丁標準曲線，計算黃酮含量。

2.4 蘆丁標準曲線的繪制

精確稱取經105℃烘干的蘆丁標準品15 mg，用80%乙醇溶解，配制成0.15 mg/mL的蘆丁標準液100 mL，精密吸取 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 的蘆丁標準液于7個潔凈的25mL容量瓶中，分別加入6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0.0 mL 的 80%乙醇，然后再分別加入5%NaNO2溶液1.0 mL，充分振蕩后靜置6 min，再分別加入10%Al（NO3）3溶液1.0 mL，充分振蕩后靜置6 min，向每個容量瓶內加入10%NaOH溶液10.0mL，最后用80%乙醇定容，充分振蕩后靜置15 min，在507 nm處測吸光值[24]。

2.5 單因素試驗

2.5.1 上柱液濃度對吸附率的影響

配制不同濃度的艾草黃酮上柱液100 mL，其濃度分別為 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL，pH5.0，以 0.8 mL/min的流速上柱進行動態吸附，分步收集流出液（5 mL/管），以流出液的顏色為參考，上柱液達到泄露點時，停止上柱，計算吸附率。

2.5.2 上柱液流速對吸附率的影響

配制0.6 mg/mL的艾草黃酮上柱液100 mL，調節酸堿性使其 pH5.0，分別以 0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL/min的流速上柱進行動態吸附，分步收集流出液（5 mL/管），以流出液的顏色為參考，上柱液達到泄露點時，停止上柱，計算吸附率。

2.5.3 上柱液pH值對吸附率的影響

配制0.6 mg/mL艾草黃酮上柱液100 mL，分別調節pH 值為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，調節流速為 0.8 mL/min，收集流出的溶液（5 mL/管），以流出液的顏色為參考，上柱液達到泄露點時，停止上柱，計算吸附率。

2.6 Box-Behnken試驗設計

根據單因素試驗結果，以上柱液濃度、流速、pH值3個因素為自變量，以吸附率為響應值，采用Box-Behnken試驗設計，進行三因素三水平的Box-Behnken試驗設計[25-26]，因素水平表如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗設計的因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment design

2.7 BP神經網絡模型建立

隨機選擇Box-Behnken試驗設計的12組試驗數據作為BP神經網絡的學習及訓練樣本，其他3組試驗數據用來檢驗所建立的神經網絡的泛化能力，根據Box-Behnken試驗的因素個數以及需要進行優化的指標的個數，設計BP神經網絡的結構[27]，選擇收斂精度10-3。

2.8 遺傳算法優化

利用遺傳算法對BP神經網絡模型進行全局尋優，以神經網絡的輸出值作為求解的目標函數值，以Box-Behnken試驗設計的數據作為初始種群，種群規模12，交叉概率0.05，變異概率0.01[28]。

2.9 吸附率的計算

式中：V0為上柱液體積，mL；C0為起始濃度，mg/mL；Vr為流出液體積，mL；Cr為過柱液濃度，mg/mL。

3 結果與討論

3.1 蘆丁標準曲線的繪制結果

蘆丁標準曲線見圖1。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 The standard curve of rutin

以蘆丁含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，得一元線性回歸方程為：y=0.339 5x+0.007 8，R2=0.997 5

3.2 單因素試驗結果

3.2.1 上柱液濃度對吸附率的影響

上柱液濃度對吸附率的影響見圖2。

圖2 上柱液濃度對吸附率的影響Fig.2 The effect of upper column concentration on adsorption rate

由圖2可知，吸附率隨上柱液黃酮質量濃度的增大而逐漸增大，當濃度大于1.0 mg/mL時吸附率出現下降趨勢，可能是由于大孔樹脂的吸附能力是有限的，當樹脂吸附達到飽和狀態時，隨著上柱液濃度的增加吸附率變化不明顯[29]。

3.2.2 上柱液流速對吸附率的影響

上柱液流速對吸附率的影響見圖3。

圖3 上柱液流速對吸附率的影響Fig.3 The effect of flow velocity of upper column fluid on adsorption rate

由圖3可知，隨上柱液流速的增加，大孔樹脂對艾草黃酮的吸附率逐漸增大，當上柱液流速大于0.8 mg/mL時，上柱液流速越大，樹脂對黃酮的吸附率越低，可能是上柱液流速過大時，黃酮類化合物未被樹脂充分吸附[30]。

3.2.3 上柱液pH值對吸附率的影響

上柱液pH值對吸附率的影響見圖4。

圖4 上柱液pH值對吸附率的影響Fig.4 The effect of upper column pH on adsorption rate

由圖4可知，上柱液pH值對吸附率的影響較大，當上柱液pH值小于5.0時，吸附率相對較高，可能是黃酮類化合物含有酸性基團，在酸性條件下更易被大孔樹脂吸附，當pH>5.0時，隨pH值的增大，吸附率明顯下降[29]。

3.3 BP神經網絡模型建立

Box-Behnken試驗結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗結果Table 2 The results of Box-Behnken experiment

圖5 BP神經網絡訓練過程Fig.5 The training process of BP neural network

根據Box-Behnken試驗的結果，采用BP神經網絡建立AB-8大孔樹脂對艾草黃酮動態吸附過程的數學模型，BP神經網絡的學習及訓練過程如圖5所示。

由圖5可知，隨訓練次數增多，BP神經網絡的訓練誤差平方和逐漸減小，經4 923次訓練，神經網絡收斂，收斂精度達10-3，說明所建立的神經網絡模型逼近能力較強[31]，可模擬AB-8大孔樹脂對艾草黃酮動態吸附過程。

3.4 遺傳算法優化結果

利用遺傳算法對所建立的BP神經網絡進行全局尋優，尋優過程如圖6所示。

圖6 遺傳算法尋優過程Fig.6 The optimizing computation process of genetic algorithm

經過100代遺傳進化，遺傳算法全局尋優的結果為：上柱液濃度1.190 1 mg/mL，流速0.407 6 mL/min，pH4.682 6；最佳的目標函數值即最優適應度（AB-8大孔樹脂對艾草黃酮動態吸附率）為90.419 2%。為便于實際操作，將遺傳算法全局尋優的結果適當修正為：上柱液濃度 1.2 mg/mL，流速 0.4 mL/min，pH4.68。

3.5 最優提取工藝的驗證試驗

根據單因素試驗結果，并與遺傳算法全局尋優修正后的結果相結合，確定AB-8大孔樹脂對艾草黃酮動態吸附的最優工藝為：上柱液濃度1.2 mg/mL，流速0.4 mL/min，pH4.68。在此條件下進行3次驗證試驗，結果取平均值，在此條件下AB-8大孔樹脂對艾草黃酮動態吸附率可達90.28%。4 結論

1）結合單因素試驗結果，利用Box-Behnken試驗數據，采用BP神經網絡建立AB-8大孔樹脂對艾草黃酮動態吸附過程的數學模型，經4 923次學習及迭代訓練，神經網絡模型收斂，收斂精度達10-3，說明所建立的神經網絡逼近輸入與輸出特性的能力比較強，可將其應用于AB-8大孔樹脂對艾草黃酮動態吸附工藝的優化。

2）利用遺傳算法對所建立的BP神經網絡進行全局尋優，結合實際條件，將遺傳算法全局尋優結果及單因素試驗結果相結合，確定AB-8大孔樹脂對艾草黃酮動態吸附最優工藝為：上柱液濃度1.2 mg/mL，流速0.4 mL/min，pH4.68。根據此條件進行3次驗證試驗，并取平均值，吸附率可達90.28%。

綜上，將單因素試驗、Box-Behnken試驗、BP神經網絡、遺傳算法相結合優化AB-8大孔樹脂對艾草黃酮動態吸附工藝是可行的，也為其他中藥材中黃酮類化合物的分離純化研究提供了有益參考。