牛樟芝液體培養(yǎng)基優(yōu)化及飲品加工工藝研究

謝春芹，許俊齊，曹正，凡軍民，謝正林，劉勇

（江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院茶與食品科技學(xué)院，江蘇句容212400）

牛樟芝（Antrodia camphorata）又名樟芝、樟內(nèi)菇、 牛樟菇等，屬于菌物界、擔(dān)子菌門、非褶菌目、多孔菌目、薄孔菌屬的珍稀藥用真菌[1]。早前，它就被臺(tái)灣原住居民用于治療長(zhǎng)期飲酒造成的肝病，被譽(yù)為“森林中的紅寶石”和“藥王之王”[2-3]。

牛樟芝是我國(guó)臺(tái)灣特有的藥用真菌，由于僅生長(zhǎng)于牛樟樹腐朽心材的內(nèi)壁中或枯死倒伏之牛樟樹潮濕表面，生長(zhǎng)非常緩慢，因此采集不易，加之人們過(guò)度采伐，牛樟樹數(shù)量日益銳減。目前，牛樟樹已被政府列為一級(jí)保護(hù)樹種[4-6]。由于牛樟芝子實(shí)體及菌絲體主要的化學(xué)成分含有三萜、多糖、腺苷等生物活性成分，且具有多種藥理活性，包括抗癌、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗疲勞、保護(hù)肝臟和免疫調(diào)節(jié)活性，尤其對(duì)肝病具有顯著療效[7-8]。同時(shí)，牛樟芝還能減少運(yùn)動(dòng)后的乳酸產(chǎn)生，起到緩解體力疲勞的作用。其中的三萜類化合物是主要的抗腫瘤的活性成分，并具有抗氧化、抗炎癥、調(diào)節(jié)生物的免疫功能等多種功效[9-10]。

近年，牛樟芝產(chǎn)業(yè)得到快速發(fā)展，培育的地域不僅在我國(guó)臺(tái)灣，各地也開始迅速發(fā)展，但是牛樟芝在牛樟木屑上生長(zhǎng)極為緩慢，無(wú)法滿足市場(chǎng)需求。本試驗(yàn)通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)篩選出適合牛樟芝菌絲生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基，并在大量菌絲培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，研究開發(fā)牛樟芝菌絲發(fā)酵飲品，以期為牛樟芝菌絲的進(jìn)一步開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛樟芝菌種：江蘇食用菌研究所提供；黃原膠、果膠、纖維素酶（120 U/g）：任丘市力輝化工有限公司；濃縮橙汁、蔗糖等：市售，食品級(jí)；其余材料：市購(gòu)所得。

FA2104N分析天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；DHG-9123A電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；L520微波爐：合肥榮事達(dá)三洋電器股份有限公司；CH2176電磁爐：杭州九陽(yáng)生活電器有限公司；HS-6恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司；JZ-350色差計(jì)：深圳金準(zhǔn)儀器設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 牛樟芝菌絲飲品加工步驟

1.2.1.1 菌種活化

將牛樟芝菌種接種到斜面培養(yǎng)基上，斜面培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分含量的組分組成：18%～20%馬鈴薯；2%～2.5%葡萄糖；1.5%～2%蛋白胨；3%～4%乳糖；3%～4%酵母浸膏；0.6%～0.8%維生素 B1；5%～7%瓊脂；0.15%～0.2%K2HPO4；0.1%～0.2%MgSO4；余量為水。斜面培養(yǎng)基在17℃～22℃條件下暗培養(yǎng)7 d～8 d，待斜面長(zhǎng)滿菌絲體。

斜面培養(yǎng)基的配制方法為：將新鮮馬鈴薯去皮，切成若干小塊（5 mm×5 mm），放入水中煮沸，文火15 min～20 min，用8層消毒紗布過(guò)濾，補(bǔ)足水分至1 000 mL，將蛋白胨、瓊脂、K2HPO4、MgSO4等加入，后將制備好的培養(yǎng)基趁熱分裝。加富培養(yǎng)基中加入酵母浸膏、乳糖相比較于PDA培養(yǎng)基提供更豐富的碳源、氮源，牛樟芝菌更好地利用吸收，利于菌絲的生長(zhǎng)。

1.2.1.2 搖瓶培養(yǎng)

將經(jīng)過(guò)斜面培養(yǎng)的牛樟芝菌種接種到搖瓶培養(yǎng)基中，一級(jí)搖瓶培養(yǎng)條件為接入經(jīng)過(guò)斜面培養(yǎng)的牛樟芝菌種 1.5 cm2，以 150 r/min～200 r/min轉(zhuǎn)速，在 20℃～30℃條件下，振蕩培養(yǎng)7 d～8 d。

1.2.1.3 二級(jí)搖瓶培養(yǎng)

將一級(jí)搖瓶培養(yǎng)牛樟芝菌種的接種到搖瓶培養(yǎng)基中進(jìn)行二級(jí)搖瓶培養(yǎng)，一級(jí)搖瓶培養(yǎng)的牛樟芝菌種與搖瓶培養(yǎng)基的體積比為10%～15%的接種量接種到搖瓶培養(yǎng)基中，以150 r/min～200 r/min轉(zhuǎn)速，在20℃～30℃條件下，培養(yǎng)5 d～8 d，所得牛樟芝菌種為生產(chǎn)搖瓶二級(jí)種。

1.2.1.4 發(fā)酵培養(yǎng)

將二級(jí)種接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，二級(jí)種與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為10%～16%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制罐溫25℃～27℃，攪拌速度100 r/min～150 r/min，通氣量 1 ∶0.4～0.8 mL/mL·min，發(fā)酵培養(yǎng) 4 d～6 d，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到一級(jí)牛樟芝菌種。

1.2.1.5 發(fā)酵罐培養(yǎng)

一級(jí)牛樟芝菌種接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵罐培養(yǎng)，過(guò)濾，得牛樟芝菌絲體。

將發(fā)酵1 d的發(fā)酵液，放罐，發(fā)酵醪料經(jīng)過(guò)濾，得新鮮的牛樟芝菌絲球，清洗過(guò)濾后的牛樟芝菌絲體及發(fā)酵液；將牛樟芝菌絲體及發(fā)酵液進(jìn)行均質(zhì)研磨，均質(zhì)為采用二級(jí)均質(zhì)工藝，將料液預(yù)熱至65℃～75℃，25 MPa～30 MPa下均質(zhì)處理 10 min～15 min，隨后在15 MPa～20 MPa均質(zhì)壓力下均質(zhì)5 min～10 min。將牛樟芝菌絲球及發(fā)酵液在其中加入0.2%纖維素酶，混勻后于38℃條件下保溫水解1.5 h；將混合料在100℃下殺菌10 min；

1.2.1.6 牛樟芝菌絲飲品制備

先將蔗糖用少量軟水溶解過(guò)濾，然后分別加入牛樟芝菌絲球酶解濾液、溶化的果膠及黃原膠、檸檬酸、山梨酸鉀攪拌均勻，最后補(bǔ)水至配方規(guī)定的量；將定容后的料液加熱至沸，趁熱加灌入已滅菌的飲料瓶、壓蓋后105℃下殺菌10 min、冷卻后得牛樟芝菌絲發(fā)酵飲品。

1.2.2 液體培養(yǎng)基單因素試驗(yàn)

前期試驗(yàn)基礎(chǔ)上，判定碳源中麥芽糖、氮源中酵母浸膏與生長(zhǎng)因素中維生素B1的添加量對(duì)牛樟芝液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)情況存在顯著影響，故設(shè)定麥芽糖添加比例為1%、2%、3%、4%、5%；酵母浸膏添加量為0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%；維生素B1添加量為0.45%、0.60%、0.75%、0.9%、1.05%，并以菌絲體鮮重及菌絲體生長(zhǎng)狀況為評(píng)價(jià)指標(biāo)，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，確定三者最優(yōu)的添加量。

1.2.3 正交試驗(yàn)

從單因素中篩選出的不同水平的麥芽糖、酵母浸膏與維生素B1添加比例，制成不同配方的液體培養(yǎng)基進(jìn)行L9（34），培養(yǎng)基正交試驗(yàn)因素及水平設(shè)定具體見(jiàn)表1。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，28℃條件下震蕩培養(yǎng)5 d，測(cè)定其菌絲體鮮重。

表1牛樟芝液體培養(yǎng)基正交L9（34）試驗(yàn)因素與水平Table 1Factors and levels of L9（34）orthogonal liquid medium for Antrodia camphorata

1.2.4 正交試驗(yàn)

在前期試驗(yàn)基礎(chǔ)上，認(rèn)為蔗糖、食鹽、檸檬酸+檸檬酸鈉及果膠+黃原膠為影響牛樟芝菌絲體發(fā)酵飲品的關(guān)鍵因素。分別設(shè)定蔗糖添加比例為4%、5%、6%；設(shè)置食鹽添加量為0.01%、0.02%、0.03%，設(shè)置檸檬酸與檸檬酸鈉添加比例為（0.3+0.03）%、（0.4+0.04）%、（0.5+0.05）%，設(shè)置果膠+黃原膠添加比例為（0.03+0.05）%、（0.04+0.09）%、（0.05+0.13）%，具體見(jiàn)表2。

表2牛樟芝菌絲發(fā)酵飲品L9（34）試驗(yàn)因素與水平Table 2Factors and levels of L9（34）orthogonal fermented drinks for Antrodia camphora mycelium

1.2.5 指標(biāo)測(cè)定方法

1.2.5.1 感官評(píng)定

取試樣置于燒杯中，在自然光下觀察色澤和組織狀態(tài)。聞其氣味，用溫開水漱口，品嘗滋味。感官品質(zhì)得分為3個(gè)指標(biāo)總和。感官評(píng)價(jià)由20位具有品評(píng)經(jīng)驗(yàn)的食品專業(yè)同學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià)，取其平均值。

外觀（10分～30分）：細(xì)膩潤(rùn)滑，組織連貫均一，無(wú)結(jié)塊和分層、無(wú)固體析出、色澤一致，無(wú)沉淀。

口感（10分～40分）：口感爽滑，口味醇厚。

風(fēng)味（10分～30分）：飲品的酸甜度適中、飲品香氣濃厚，獨(dú)特飲品酵香。

1.2.5.2 牛樟芝菌絲體鮮重測(cè)定方法

牛樟芝菌絲體發(fā)酵液，采用100目篩網(wǎng)過(guò)濾，將菌絲體用蒸餾水沖洗數(shù)次，瀝干，稱重后，即得牛樟芝菌絲體鮮重。

1.2.5.3 微生物指標(biāo)的測(cè)定

菌落總數(shù)按照GB 4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

牛樟芝液體菌種培養(yǎng)基中添加麥芽糖時(shí)，菌絲鮮重隨添加比例的增高，菌絲含量增加。原因在于麥芽糖屬于二糖，易于被牛樟芝菌絲體快速利用又可以滿足菌絲后期生長(zhǎng)的需要。麥芽糖添加量對(duì)牛樟芝菌絲體鮮重的影響具體見(jiàn)圖1。

圖1 麥芽糖添加量對(duì)牛樟芝菌絲體鮮重的影響Fig.1 Effect of maltose addition on the fresh weight of Antrodia camphorata mycelium

由圖1分析得出，麥芽糖添加量為3%時(shí)，牛樟芝菌絲含量達(dá)到高點(diǎn)，當(dāng)添加量為4%，菌絲鮮重與添加比例為3%時(shí)增加不明顯，故選擇麥芽糖添加量為3%作為最適培養(yǎng)基碳源比例。

酵母浸膏富含完全蛋白質(zhì)，富含大量氨基酸、維生素、核苷酸及微量元素等，常被用作生物培養(yǎng)基原料，功效遠(yuǎn)大于酵母，并對(duì)提高菌種的生產(chǎn)速率具有明顯作用。酵母浸膏添加量對(duì)牛樟芝菌絲體鮮重的影響見(jiàn)圖2。

由圖2分析可知，酵母浸膏的添加量對(duì)牛樟芝菌絲鮮重影響較為明顯，當(dāng)添加量為0.6%時(shí)，每100 mL培養(yǎng)液中的菌絲鮮重達(dá)到8.76 g，隨添加比例增加，牛樟芝鮮重增加不明顯，原因可能在于，過(guò)量營(yíng)養(yǎng)對(duì)于菌絲增長(zhǎng)并無(wú)明顯作用，據(jù)此選擇0.6%的酵母浸膏添加量為最適液體培養(yǎng)基添加量。

維生素B1又稱硫胺素，常被用作液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)促進(jìn)因子，在碳素化合物代謝過(guò)程中，具有一定促進(jìn)作用。維生素B1添加量對(duì)牛樟芝菌絲體鮮重的影響見(jiàn)圖3。

圖2 酵母浸膏添加量對(duì)牛樟芝菌絲體鮮重的影響Fig.2 Effect of the amount of yeast extract on the fresh weight of Antrodia camphorata mycelium

圖3 維生素B1添加量對(duì)牛樟芝菌絲體鮮重的影響Fig.3 Effect of vitamin B1addition on fresh weight of Antrodia camphorata mycelium

由圖3分析得出，隨著維生素B1添加量的增加，存在于液體培養(yǎng)基中的牛樟芝菌絲鮮重呈現(xiàn)先增大再減小的趨勢(shì)，即為當(dāng)添加量為0.75%時(shí)，菌絲鮮重達(dá)到9.55 g/100 mL，添加量增加至0.9%，菌絲體鮮重有所下降，但具體機(jī)理尚不清楚。故認(rèn)為維生素B1添加量為0.75%為最適宜的添加量。

2.2 牛樟芝液體培養(yǎng)基工藝優(yōu)化

2.2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析

液體培養(yǎng)基L9（34）試驗(yàn)結(jié)果分析見(jiàn)表3。

從表3牛樟芝液體培養(yǎng)基正交試驗(yàn)結(jié)果中的R值可知，影響牛樟芝菌絲鮮重的因素主次順序?yàn)锳＞B＞C，即麥芽糖添加量＞酵母浸膏添加量＞維生素B1添加量。依據(jù)菌絲鮮重的結(jié)果分析可知，優(yōu)化的工藝組合均為A2B3C1，即麥芽糖的添加量為3.0%，酵母浸膏添加量控制在0.65%，維生素B1添加量0.65%，牛樟芝菌絲體鮮重達(dá)到最高值。

表3液體培養(yǎng)基L9（34）試驗(yàn)結(jié)果分析Table 3Analysis of results of liquid medium L9（34）

表4 牛樟芝菌絲鮮重方差分析Table 4 Analysis of variance of fresh weight of Antrodia camphorata mycelium

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，表4數(shù)據(jù)顯示，在本研究條件下，麥芽糖添加量對(duì)樣品菌絲鮮重的影響極顯著（P<0.01），酵母浸膏添加量對(duì)其影響顯著（P<0.05），而維生素B1添加量則對(duì)牛樟芝菌絲鮮重影響不顯著。

2.2.2 擴(kuò)大性驗(yàn)證試驗(yàn)

雖然本研究獲得的優(yōu)化方案A2B3C1，存在本次試驗(yàn)中的6號(hào)試驗(yàn)組，為了進(jìn)一步確認(rèn)其在實(shí)際生產(chǎn)中的可靠性與可行性，故以其為條件，即麥芽糖的添加量為3.0%，酵母浸膏添加量控制在0.65%，維生素B1添加量0.65%，進(jìn)行擴(kuò)大性（中試）驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)定其鮮重平均值為14.58 g/100 mL，試驗(yàn)結(jié)果優(yōu)于正交試驗(yàn)的9組試驗(yàn)組，故認(rèn)為此配方為較佳的牛樟芝液體培養(yǎng)基組成。

2.3 牛樟芝菌絲發(fā)酵飲品調(diào)配工藝優(yōu)化

2.3.1 正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析

牛樟芝菌絲發(fā)酵飲品調(diào)配L9（34）試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，牛樟芝菌絲鮮重方差分析見(jiàn)表6。

表5牛樟芝菌絲發(fā)酵飲品調(diào)配L9（34）試驗(yàn)結(jié)果Table 5Test results of L9（34）of blended fermented drinks for Antrodia camphora mycelium

表6 牛樟芝菌絲鮮重方差分析Table 6 Analysis of variance of fresh weight of Antrodia camphorata mycelium

從表5牛樟芝菌絲發(fā)酵飲品調(diào)配工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果中的R值可知，影響其綜合評(píng)分的因素主次順序?yàn)镃＞A＞B＞D，即檸檬酸+檸檬酸鈉＞蔗糖量＞食鹽添加量＞果膠+黃原膠。依據(jù)綜合評(píng)分的結(jié)果分析可知，優(yōu)化的工藝組合均為A1B3C2D2，即蔗糖的添加量為4%，食鹽添加量控制在0.03%，檸檬酸0.4%+檸檬酸鈉0.04%，果膠0.04%及黃原膠0.09%。外觀、口感及風(fēng)味的綜合值均保持在最高。

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，表6數(shù)據(jù)顯示，在本研究條件下，檸檬酸+檸檬酸鈉添加量與蔗糖添加量對(duì)牛樟芝菌絲發(fā)酵飲品的綜合口感影響極顯著（P<0.01），食鹽添加量對(duì)其影響顯著（P<0.05），而果膠+黃原膠對(duì)其影響次之。

2.3.2 擴(kuò)大性驗(yàn)證試驗(yàn)

雖然本研究獲得的優(yōu)化方案A1B3C2D2，不存在本次試驗(yàn)組中，為了進(jìn)一步確認(rèn)其在實(shí)際生產(chǎn)中的可靠性與可行性，故以其為條件，即牛樟芝菌絲飲品調(diào)配配方為蔗糖的添加量為4%，食鹽添加量控制在0.03%，檸檬酸0.4%+檸檬酸鈉0.04%，果膠0.04%及黃原膠0.09%，進(jìn)行擴(kuò)大性（中試）驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3次，經(jīng)品評(píng)后，綜合得分達(dá)86.1分，試驗(yàn)結(jié)果均優(yōu)于正交試驗(yàn)的9組試驗(yàn)組，故認(rèn)為此配方為較佳的牛樟芝菌絲飲品的適宜配方。

通過(guò)對(duì)在最佳工藝條件下制得的牛樟芝發(fā)酵菌絲飲料進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，其顏色均一，組織狀態(tài)均勻，無(wú)沉淀，具有牛樟芝飲品特有的風(fēng)味，甜爽適口，無(wú)不良異味，口感順滑，無(wú)肉眼可見(jiàn)雜質(zhì)。

2.4 微生物指標(biāo)檢驗(yàn)

牛樟芝菌絲飲品的微生物檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 微生物檢驗(yàn)結(jié)果Table 7 The results of microbiological test

由表7試驗(yàn)結(jié)果分析表明，牛樟芝菌絲飲品的細(xì)菌總數(shù)≤100 CFU/mL，大腸桿菌≤3 MPN/100 mL，致病菌未檢出，符合GB 7101-2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)飲料》中關(guān)于微生物限量的安全標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

對(duì)牛樟芝液體培養(yǎng)基碳源、氮源及生長(zhǎng)因子優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為，麥芽糖的添加量為3.0%，酵母浸膏添加量控制在0.65%，維生素B1添加量0.65%，牛樟芝菌絲體鮮重高于其他試驗(yàn)組，達(dá)到14.58 g/100 mL最高值；在對(duì)牛樟芝菌絲發(fā)酵飲品調(diào)配工藝過(guò)程中，通過(guò)正交試驗(yàn)分析得出，最優(yōu)組合為蔗糖的添加量為5%，食鹽添加量控制在0.03%，檸檬酸0.4%+檸檬酸鈉0.04%，果膠0.04%及黃原膠0.09%，以綜合感官評(píng)價(jià)認(rèn)為此配方制得的牛樟芝菌絲飲品，在保證口感的同時(shí)，后期貯藏驗(yàn)證其穩(wěn)定性也較高。

該牛樟芝菌絲發(fā)酵飲品，在保留牛樟芝菌絲原有的活性功能基礎(chǔ)之上，添加濃縮橙汁，使牛樟芝飲品的營(yíng)養(yǎng)更加豐富，風(fēng)味獨(dú)特，口感更加細(xì)膩，在市場(chǎng)上將有較好的市場(chǎng)前景。