植物中花青素含量測定及種類分布研究

彭祖茂，鄧夢雅，嚴虞虞，朱麗，張協(xié)光

（深圳市計量質(zhì)量檢測研究院，廣東深圳518131）

花青素（anthocyanidin）屬黃酮類化合物，又稱花色素，是廣泛存在于植物中的水溶性天然色素。據(jù)統(tǒng)計27個科，73個屬的500多種植物含有花青素[1]，以葡萄皮、藍莓、黑枸杞等含量最為豐富[2-11]?；ㄇ嗨匾蚱滟Y源豐富和安全無毒，同時擁有一定的營養(yǎng)和藥用價值，在食品，醫(yī)藥、化妝品等方面擁有較大的發(fā)展市場。自然界中現(xiàn)已知的花青素有20多種，主要有天竺葵、矢車菊素、飛燕草素、甲基花青素、牽?；ㄉ睾湾\葵色素6種。自然界中花青素少以游離態(tài)的形式出現(xiàn)，常與一個或多個葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖等通過糖苷鍵形成花色苷，已被發(fā)現(xiàn)天然存在的花色苷有250多種，可從不同植物中提取獲得?；ㄇ嗨貭I養(yǎng)價值高，研究者們試圖尋找花青素含量豐富的植物原料，從中提取花青素并投入到商業(yè)生產(chǎn)，開拓花青素應(yīng)用市場。已投入商業(yè)生產(chǎn)的有葡萄皮色素，漿果類（草莓、楊梅、枸杞、藍莓），紫薯等。

為實現(xiàn)花青素質(zhì)量控制，需要采用合適的方法對其進行檢測?；ㄇ嗨爻Ｓ脵z測方法有紫外分光光度法，高效液相色譜法和高效液相色譜法/質(zhì)譜聯(lián)用法。紫外分光光度法常用于花青素總量的檢測，往往受pH值、溫度等外在條件影響，同時也會受原花青素、花白素等物質(zhì)的干擾，分析結(jié)果往往偏高，靈敏度低。高效液相色譜法適用于分析樣品中不同種類花青素的含量，相對高效液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜成本低，需要標(biāo)物才能定性樣品。高效液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜法常用于樣品中花青素種類的全分析，獲取信息更全[12-14]。花青素的檢測根據(jù)檢測目標(biāo)物不同，可以分為檢測花色苷和檢測花青素母核。自然界中花色苷存在形式繁多。例如，黑枸杞[15]中花青素存在有飛燕草素-3-O-葡萄糖苷，矮牽牛素-5-O-葡萄糖苷，矮牽牛素-3-O-6-O-對香豆酰）蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷，錦葵色素-3-O-6-O-對香豆酰-3-O-乙酰）-5-O-二葡萄糖苷，飛燕草-3-O-6-O-乙酰）葡萄糖苷，錦葵色素-3-O-6-O-對香豆酰）葡萄糖苷和錦葵色素-3-5-二葡萄糖苷等；巨峰葡萄中含有矢車菊素-3-O-葡萄糖苷，錦葵色素-3-O-葡萄糖苷，錦葵色素香豆素葡萄糖苷，矢車菊素乙酰葡萄糖苷，甲基矢車菊素乙酰葡萄糖苷，錦葵色素乙酰葡萄糖苷，甲基矢車菊素香豆素葡萄糖苷，甲基矢車菊素葡萄糖苷等形式花色苷。不同樣品中花色苷形式不同，加之標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)昂貴，有些甚至根本沒有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，因此檢測花色苷存在一定困難；由于自然界中花青素的母核主要有6種，選取合適試驗試劑，采用適當(dāng)?shù)姆椒▽悠分谢ㄉ账獬苫ㄇ嗨貑误w后，便能實現(xiàn)不同種樣品中花青素的統(tǒng)一檢測，解決了因花色苷標(biāo)物購買難而導(dǎo)致花青素檢測困難的問題，是一種簡單可行的方法。

本文選取黑枸杞、紫薯、藍莓、沙棘、玫瑰王、山楂、櫻桃、黑桑葚、青提、黑葡萄、紅提、巨峰葡萄、金銀花、貢菊、菊花、胎菊和野菊花等17種不同植物含花青素高的部位，包括根，莖或花。參照“NY/T 2640-2014《植物源性食品中花青素的測定高效液相色譜法》，用酸性無水乙醇溶液從不同植物中提取花青素，通過高效液相色譜法準(zhǔn)確定量其中主要花青素的含量。旨在通過對不同植物中花青素含量的研究，指導(dǎo)企業(yè)及相關(guān)機構(gòu)實現(xiàn)花青素的質(zhì)量控制，為開拓花青素應(yīng)用市場奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

黑枸杞、紫薯、藍莓、沙棘、玫瑰王、山楂、櫻桃、黑桑葚、青提、黑葡萄、紅提、巨峰葡萄、金銀花、貢菊、菊花、胎菊、野菊花：超市。

1.1.2 試劑

無水乙醇、甲酸、甲醇（均為色譜純）：德國默克股份兩合公司；鹽酸（優(yōu)級純）：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇+水+鹽酸（2∶1∶1，體積比）。

1.1.3 標(biāo)物

飛燕草色素（Delphinidin，Dp，94.7%），矢車菊色素（Cyanidin，Cy，95%），矮牽牛色素（Petunidin，Pt，94.1%），天竺葵色素（Pelargonidin，Pg，93%），芍藥色素（Peonidin，Pn，97.6%）和錦葵色素（Malvidin，Mv，94.8%），均為鹽酸鹽形式：Sigma-Aldrich。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA323S-CW電子天平：賽多利斯公司；Agilent 1260高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；SK2510LHC超聲提取儀：上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花青素提取

參照NY/T 2640-2014《植物源性食品中花青素的測定高效液相色譜法》樣品前處理方法，準(zhǔn)確稱取0.5 g～2 g樣品于50 mL具塞比色管中，加入無水乙醇+水+鹽酸（2∶1∶1，體積比）定容至刻度，搖勻，超聲提取30 min后，于沸水浴中水解1 h，取出后冷卻，用無水乙醇+水+鹽酸（2∶1∶1，體積比）定容。靜置，取上清液，用0.45 μm水相濾膜過濾，待測。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Zorbax SB C18（250 mm×4.6 mm，2.5 μm），流動相：A，1%甲酸水溶液；B，1%甲酸乙腈溶液；流速0.8 mL/min；梯度洗脫，0～2.0 min流動相B從8.0%～12.0%；5 min，18%B；10.0 min，20%B；12 min，25%B；15 min，30%B；18 min，45%B；20 min，80%B；22 min～30 min，8%B；檢測波長：530 nm；柱溫：35 ℃。

1.3.3 水分測定

參照GB 5009.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物樣品中花青素含量的測定

花青素的結(jié)構(gòu)母核是2-苯基苯并吡喃陽離子（如圖1）[16]。

圖1 花青素結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of anthocyanin

由于R1、R2取代基團不同，導(dǎo)致6種花青素在色譜柱上保留時間不同而實現(xiàn)分離，6種花青素出峰順序如圖2所示。

圖2 6種花青素標(biāo)液的高效液相色譜圖Fig.2 Chromatogram of six anthocyanins in standard

采用高效液相色譜配備二極管陣列檢測器，在530 nm測得植物中6種花青素紫外吸收，樣品中花青素譜圖如圖3所示。

圖3 樣品中花青素色譜圖Fig.3 Chromatogram of anthocyanins in sample

表1 6種花青素線性方程及相關(guān)系數(shù)Table 1 The linear equation and regression coefficient of six different anthocyanins

表2 不同植物中花青素的含量Table 2 Anthocyanin content in different plants以干基計，mg/kg

根據(jù)濃度和峰面積做標(biāo)準(zhǔn)曲線（6種花青素線性方程及相關(guān)系數(shù)如表1所示），求得各樣品中花青素的準(zhǔn)確含量，結(jié)果以干基計，結(jié)果見表2。

如表1所示，采用液相色譜分析6種花青素，其相關(guān)系數(shù)（r）均≥0.999 8。表明液相色譜法可用于樣品中6種花青素含量檢測。從表2結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6種花青素在不同植物體中的分布不同，其含量差異大。6種花青素在樣品中的最高檢出分別為：飛燕草色素596 mg/kg；矢車菊色素1 025 mg/kg；矮牽牛素4 671 mg/kg；天竺葵色素21 mg/kg；芍藥色素1 005 mg/kg；錦葵色素1 000 mg/kg。其中矢車菊色素在植物中分布最廣，這也是現(xiàn)行紫外分光光度法采用矢車菊色素作為標(biāo)物，來測定樣品中花青素含量的主要原因；其次，天竺葵色素分布最少，僅玫瑰王和黑桑葚中有檢出。飛燕草色素主要存在于黑枸杞，藍莓，沙棘和黑葡萄中；除黑枸杞和菊花類物質(zhì)外，其余樣品中均含有矢車菊素，以藍莓中含量最高；矮牽牛色素在黑枸杞，藍莓和黑葡萄中均有檢出，且黑枸杞中含量最高。天竺葵色素不僅在植物界分布少，且其在植物中含量還很低；芍藥色素是僅次于矢車菊色素分布較廣的色素，尤以玫瑰王中檢出最高；錦葵色素在黑枸杞、藍莓、黑葡萄、巨峰葡萄中均有檢出，其中藍莓中含量最高。

為了更加清晰地了解不同植物中花青素的分布，不同樣品中花青素分布見圖4。

圖4可以發(fā)現(xiàn)，黑枸杞中花青素含量高，藍莓次之，菊花類產(chǎn)品中均未檢出任何種類花青素，有研究表明，菊花中主要含黃酮類、黃酮醇類等物質(zhì)[17-19]，有較強抗氧化自由基活性以及抗菌及抗病毒活性，是菊花類植物體內(nèi)重要的抗氧化活性物質(zhì)。此外，還發(fā)現(xiàn)藍莓和黑葡萄中花青素在所檢植物中種類較為齊全，均含有飛燕草色素，矢車菊色素，矮牽牛色素，芍藥色素和錦葵色素。結(jié)果表明，藍莓和黑葡萄是花青素攝入的最佳選擇。在所檢樣品中還發(fā)現(xiàn)，金銀花中含有75 mg/kg矢車菊色素。金銀花和菊花皆是植物飲料的主要原料，由此可以推斷，金銀花可作為植物飲料中花青素的重要來源之一。

圖4 不同樣品中花青素分布Fig.4 Anthocyanin distribution in different samples

圖5 17種樣品系統(tǒng)聚類分析后譜系圖Fig.5 The pedigree chart of 17 samples after cluster analysis

2.2 不同植物樣品中花青素聚類分析

以花青素含量為指標(biāo)，采用系統(tǒng)聚類分析法對17種樣品進行聚類分析，得到結(jié)果如圖5所示。

從圖5中發(fā)現(xiàn)，聚類分析結(jié)果與樣品中花青素總量分布有相似趨勢，除黑枸杞，藍莓和玫瑰王外，剩下樣品可分為一類，共計4類?；ㄇ嗨卦谥参飿悠分蟹植伎纱笾聻楹阼坭?，藍莓，玫瑰王及其他。對其分組情況進行判別，得到全部組散點圖，如圖6所示。

從圖6中發(fā)現(xiàn)，除黑枸杞，藍莓和沙棘外，其他樣品的質(zhì)心均較為集中。黑枸杞和沙棘較藍莓又更為離散，可能是因為黑枸杞中含有高含量矮牽牛色素，而其他樣品中矮牽牛色素含量較低，甚至沒有；沙棘中花青素主要為飛燕草色素，也是其他樣品中含量較少的一種花青素。不同植物樣品中花青素的聚類分析，有利于對可能含花青素樣品的了解，為企業(yè)選料，原料溯源等提供技術(shù)支持。

圖6 17種樣品系統(tǒng)判別函數(shù)全部組散點圖Fig.6 All group scatter plot of 17 kinds of samples system discriminant function

3 結(jié)論

通過高效液相色譜法分析得到不同樣品中花青素的分布；同時，以花青素為變量對不同樣品中花青素聚類分析后，結(jié)果表明：矢車菊色素在植物中分布最廣，天竺葵色素分布最少，藍莓和黑葡萄是花青素攝入的最佳選擇，金銀花可作為植物飲料中花青素的重要來源。自然界中花青素樣品除黑枸杞，藍莓，玫瑰王外，其他樣品中花青素分布相似，含量并不高。因此，黑枸杞，藍莓和玫瑰王可作為花青素主要原料來源。