HPLC檢測黑皮雞樅菌中的水溶性維生素

李艷

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050018）

雞樅菌（Termitomyces spp.）又叫傘把菇、雞絲菇、蟻巢傘、三壇菌等[1-2]，隸屬于擔(dān)子菌亞門，層菌綱，傘菌目，口蘑科，是一種味道鮮美、營養(yǎng)豐富的珍貴野生食用菌[3-4]，主要分布在南亞、東亞、非洲以及南太平洋島嶼等熱帶和亞熱帶地區(qū)，我國云南省是世界雞樅菌的主要分布區(qū)域之一，種類豐富且產(chǎn)量較大。維生素是一種維持機(jī)體正常生理功能所必須的營養(yǎng)物質(zhì)[5]，它不是構(gòu)成機(jī)體組織和細(xì)胞的原料，也不是能量的主要來源，而是一種在物質(zhì)代謝中起重要作用的調(diào)節(jié)物質(zhì)。絕大多數(shù)維生素在體內(nèi)不能合成或合成量很少，不能滿足機(jī)體的需求，需要通過額外攝入食物來補(bǔ)充，盡管機(jī)體需求量很少但一旦攝入量不足就會(huì)引起相應(yīng)的維生素缺乏癥，造成機(jī)體的損傷。按照維生素的溶解性可分為水溶性和脂溶性兩類，水溶性維生素主要包括維生素C和部分B族維生素（維生素B1、維生素 B2、維生素 B6、維生素 B12、煙酸、葉酸和泛酸），脂溶性維生素包括維生素A、維生素D、維生素E、維生素K等。檢測維生素的方法主要有分光光度法[6]、熒光分析法[7]、薄層層析法[8]和液相色譜法[9-12]等。高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）操作簡單、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高是目前檢測食品中水溶性維生素最常用的方法。大量文獻(xiàn)[13-14]針對(duì)雞樅菌中的蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、總糖、還原糖、灰分和礦物元素等基礎(chǔ)成分進(jìn)行了分析研究，至今未見對(duì)雞樅菌中維生素類營養(yǎng)成分的分析報(bào)道。本研究旨在建立采用HPLC同時(shí)定性、定量分析檢測新鮮黑皮雞樅菌和菌粉中7種水溶性維生素的方法，為其深度開發(fā)與利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮黑皮雞樅菌和菌粉均由河北靈濟(jì)食用菌有限公司提供。

維生素C標(biāo)品（分析純）：天津博迪化工股份有限公司；維生素 B1、維生素 B2、維生素 B6、維生素 B12、煙酸、葉酸標(biāo)品（分析純）：美國Sigma公司；磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、三乙胺（分析純）：天津永達(dá)化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純）：天津星馬克科技發(fā)展有限公司；試驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。

1.2 儀器與設(shè)備

SHIMADZU高效液相色譜儀（HPLC）LC-20A、Inertsil ODS-SP（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱：日本島津公司；Spectrum 756p紫外可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SHZ-Ш循環(huán)水式多用真空泵：上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司；DELTA320pH計(jì)：梅特勒·托利多儀器有限公司；ARI140型電子分析天平：美國奧豪斯儀器有限公司；微孔過濾器：天津市南開區(qū)百順百通儀器設(shè)備銷售部。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

流動(dòng)相的配制：稱取6.8 g KH2PO4，溶于1 000 mL水中，得到0.05 mol/L的KH2PO4溶液[15]，用三乙胺調(diào)節(jié)pH=6.0。流動(dòng)相使用前用0.45 μm膜過濾后超聲脫氣15 min。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：分別稱取維生素C、維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12、煙酸和葉酸標(biāo)準(zhǔn)品各 10 mg，維生素 C、維生素 B1、維生素 B6、維生素 B12、煙酸直接用水溶解后定容到10 mL棕色容量瓶中，維生素B2和葉酸先用少量0.1 mol/L的NaOH溶液溶解后再用水定容到10 mL棕色容量瓶中，得到濃度均為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于4℃冰箱中備用[16]。

混合標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制：分別吸取維生素B1、維生素B12標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各0.8 mL，維生素B6、煙酸和葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各0.4 mL，維生素C、維生素B2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各0.1 mL混合在一起得到混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，再用水稀釋到所需的濃度，進(jìn)樣前過0.45 μm膜。

1.3.2 樣品的制備

新鮮黑皮雞樅菌樣品處理：隨機(jī)挑選新鮮的黑皮雞樅菌，分成菌蓋、菌腿和完整菌3份樣品，分別切丁，打漿或充分研磨，稱取適量樣品，加45 mL水進(jìn)行超聲提取30 min，4 500 r/min離心15 min，用布氏漏斗過濾，取濾液定容到50 mL，過0.45 μm膜過濾，進(jìn)樣。

黑皮雞樅菌菌粉的處理：稱取適量菌粉，加45mL水超聲提取30 min，4 500 r/min離心15 min，用布氏漏斗過濾，取濾液定容到50 mL，過0.45μm膜過濾，進(jìn)樣。

1.3.3 色譜條件

流動(dòng)相：A 為 0.05 mol/L KH2PO4溶液（pH=6.0）；B為甲醇；流速：0.8 mL/min；柱溫：室溫；檢測波長：268 nm；進(jìn)樣量：20 μL；梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3.4 維生素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及檢出限和定量限

取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液稀釋成6個(gè)不同濃度值，每個(gè)濃度值重復(fù)進(jìn)樣3次取平均值，以響應(yīng)值峰面積y對(duì)質(zhì)量濃度x作線性方程：y=ax+b，進(jìn)行線性回歸分析。檢出限（limit of determination，LOD）為3倍信噪比，定量限（limit of quantification，LOQ）為 10倍信噪比。

1.3.5 精密度和回收率

精密度：取20 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）來表征方法的精密度。

回收率：采用不含維生素的樣品為基質(zhì)進(jìn)行空白加標(biāo)，分3個(gè)濃度值，以外標(biāo)法計(jì)算加標(biāo)回收率，每個(gè)濃度值重復(fù)進(jìn)樣5次，以加標(biāo)回收率來表征方法的準(zhǔn)確性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

色譜數(shù)據(jù)分析采用儀器自帶軟件進(jìn)行處理。所有線性方程、精密度及回收率試驗(yàn)的數(shù)據(jù)均由Excel 2007處理得出。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測波長的選擇

通過紫外可見分光光度計(jì)對(duì)7種水溶性維生素標(biāo)品溶液進(jìn)行全波長掃描，最佳吸收波長見表2。

表2 維生素最佳吸收波長Table 2 The best absorption wavelength of vitamins

由表2可知7種水溶性維生素的最佳吸收波長雖不一致，但較為接近，在270 nm左右均有較高的吸光度，因此本研究確定試驗(yàn)的最終檢測波長為268 nm。

2.1.2 色譜柱的選擇

試驗(yàn)比較了 Hypersil ODS2（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱和 Inertsil ODS-SP（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱對(duì)7種水溶性維生素的分離效果，結(jié)果表明使用Inertsil ODS-SP（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱時(shí)，7種維生素實(shí)現(xiàn)了良好的分離，分離度大于3且峰形尖銳，因此試驗(yàn)最終選擇 Inertsil ODS-SP（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱。

2.1.3 流動(dòng)相pH值的確定

流動(dòng)相的pH值是影響維生素分離的一個(gè)重要因素，試驗(yàn)研究了不同pH值的流動(dòng)相KH2PO4溶液對(duì)7種水溶性維生素的分離效果，結(jié)果表明當(dāng)pH<6時(shí)維生素B1和維生素B6不能完全分離，當(dāng)pH=6時(shí)7種水溶性維生素實(shí)現(xiàn)了良好的分離，當(dāng)pH>6時(shí)7種水溶性維生素雖能分離但峰面積有減少的趨勢，且部分維生素特別是維生素C在偏中性條件下不穩(wěn)定，綜合考慮最終確定流動(dòng)相的pH=6。在調(diào)節(jié)pH值時(shí)，試驗(yàn)比較了0.1 mol/L的NaOH溶液和三乙胺對(duì)分離效果的影響，結(jié)果表明使用三乙胺調(diào)節(jié)pH值時(shí)，操作更簡單且峰形明顯優(yōu)于NaOH溶液。

2.1.4 流速和柱溫的選擇

研究比較了流動(dòng)相的流速對(duì)7種水溶性維生素分離效果的影響，結(jié)果表明，在流速分別為0.6、0.8、1.0 mL/min選擇時(shí)，流速為0.6 mL/min分離時(shí)間較長且出峰時(shí)間靠后；流速為0.8 mL/min和1.0 mL/min時(shí)，7種維生素均可在22 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)良好分離，考慮到流速越大泵壓越高，對(duì)色譜柱和儀器損傷較大，因此最終確定流速為0.8 mL/min。改變柱溫發(fā)現(xiàn)除了保留時(shí)間略微縮短之外對(duì)維生素的分離和定性定量分析沒有明顯的影響，因此選擇在室溫條件下操作。

2.1.5 梯度洗脫程序的優(yōu)化

試驗(yàn)首先研究了在等度洗脫條件下7種維生素的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)有機(jī)相的濃度進(jìn)行等度洗脫不能實(shí)現(xiàn)維生素的良好分離，因此改為梯度洗脫，并通過對(duì)梯度洗脫程序的不斷優(yōu)化最終確定了表1所示的洗脫程序，7種維生素在22 min之內(nèi)實(shí)現(xiàn)了良好分離，且分離度都大于3。

通過對(duì)色譜條件的優(yōu)化，7種維生素實(shí)現(xiàn)了分離和同時(shí)檢測，結(jié)果見圖1。

由圖1可知7種維生素均達(dá)到了基線分離，可用于維生素的定性定量分析。

2.2 維生素檢測方法的建立

2.2.1 維生素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及檢出限和定量限

按照最優(yōu)色譜條件對(duì)各維生素標(biāo)品進(jìn)行HPLC分析，各維生素的線性相關(guān)系數(shù)R2、線性范圍、檢出限LOD、定量限LOQ如表3所示。

圖1 維生素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 Standard chromatogram of vitamin

表3 各維生素的線性相關(guān)系數(shù)、線性范圍、LOD、LOQ及RSDTable 3 The linear correlation coefficient，linear range，detection limit，quantitative limit and relative standard deviation of each vitamin

由表3可知各維生素的線性相關(guān)系數(shù)在0.999 6～1.000 0之間，表明線性關(guān)系良好，最低檢出限在0.15 μg/mL～1.52 μg/mL 之間，定量限在 0.49 μg/mL～5.08 μg/mL 之間。

2.2.2 精密度和回收率

以峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD來表征方法的精密度，以不含維生素的樣品為基質(zhì)進(jìn)行空白加標(biāo)計(jì)算加標(biāo)回收率，以加標(biāo)回收率來表征方法的準(zhǔn)確性，結(jié)果見表4。

表4 各維生素的加標(biāo)回收率Table 4 Standard addition recovery rate of each vitamin

由表4可知7種維生素的RSD在0.31%～7.04%之間，表明精密度良好[17-18]。由表4可知7種維生素的加標(biāo)回收率在88.07%～106.01%之間，回收率較高[19-20]，說明方法的準(zhǔn)確性良好。

2.3 雞樅菌中水溶性維生素含量的測定

按照1.3.2所述方法對(duì)樣品進(jìn)行處理后，按照所建立的方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測，以保留時(shí)間進(jìn)行定性，以外標(biāo)法進(jìn)行定量，新鮮黑皮雞樅菌及菌柄、菌傘和菌粉中水溶性維生素含量的檢測結(jié)果見表5。

表5 雞樅菌中水溶性維生素含量Table 5 The content of water soluble vitamin in Termitomyces spp.

由表5可知，新鮮黑皮雞樅菌中檢測到4種水溶性維生素，菌粉中檢測到5種水溶性維生素且都以維生素C和煙酸為主。新鮮黑皮雞樅菌及菌粉中維生素C和煙酸總量分別占總維生素含量的86.47%和87.97%，其中維生素C的含量分別占總維生素含量的59.37%和50.62%，維生素C能夠維持免疫功能，保持血管完整，促進(jìn)非血紅素鐵的吸收，同時(shí)維生素C還具有抗氧化，抗自由基，抑制酪氨酸酶的形成等功能，從而達(dá)到美白，淡斑的功效。煙酸的含量分別占總維生素含量的27.10%和37.35%，煙酸有較強(qiáng)的擴(kuò)張周圍血管的能力，能維持消化系統(tǒng)的健康、減輕胃腸道障礙，同時(shí)還可以預(yù)防和緩解嚴(yán)重的偏頭痛且對(duì)緩解皮炎和腹瀉癥狀具有明顯的效果。由此可見，多食用以雞樅菌為主要原料的產(chǎn)品對(duì)于維持機(jī)體正常功能、保護(hù)胃腸道和美白養(yǎng)顏等具有重要作用。菌粉中葉酸含量占總維生素含量的1.82%，而新鮮黑皮雞樅菌中未檢測到葉酸，可能是由于新鮮黑皮雞樅菌中葉酸含量過低超出了該方法的檢出限。

完整的黑皮雞樅菌主要由菌柄和菌傘兩部分組成，菌柄和菌傘也都檢測到4種水溶性維生素且都以維生素C和煙酸為主。菌柄和菌傘中維生素C和煙酸總量分別占總維生素含量的88.57%和86.92%，其中維生素C含量分別占總維生素含量的52.90%和64.47%，煙酸含量分別占總維生素含量的35.67%和22.45%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)菌傘中維生素C的含量是菌柄中維生素C含量的1.48倍，維生素B2含量是菌柄中含量的3.40倍；菌柄中煙酸含量是菌傘中煙酸含量的1.31倍，維生素B1含量是菌傘中含量的1.22倍。菌傘中總維生素含量是菌柄中總維生素含量的1.21倍。以上數(shù)據(jù)為黑皮雞樅菌不同部位營養(yǎng)價(jià)值的開發(fā)提供了理論依據(jù)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了一種簡單、快速、準(zhǔn)確并可同時(shí)檢測7種水溶性維生素的方法，利用此方法對(duì)新鮮黑皮雞樅菌、菌粉、菌柄和菌傘進(jìn)行定性和定量分析，結(jié)果表明黑皮雞樅菌水溶性維生素含量豐富且以維生素C和煙酸為主，維生素C和煙酸對(duì)于維持機(jī)體正常功能、保護(hù)胃腸道和美白養(yǎng)顏等具有重要作用。檢測方法的建立和檢測數(shù)據(jù)結(jié)果為黑皮雞樅菌的開發(fā)利用和深度加工奠定了一定的理論基礎(chǔ)。