水產品中14種抗生素藥物殘留檢測方法的建立

金鑰，孫延斌，梅連瑞，李經緯

（1.天津市產品質量監督檢測技術研究院，天津300308；2.天津津濱華測產品檢測中心有限公司，天津300300）

近年來，水產品的消費呈逐年遞增趨勢[1]。獸藥的濫用、誤用、不遵守休藥期等諸多問題，是導致水產品安全問題、引起貿易爭端的主要原因[2]。本試驗檢測的大環內酯類、林可胺類、硝基咪唑類藥物所針對水產品的最大殘留限量（maximum residue limit，MRLs）并不完全，而目前國標針對于水產樣品的前處理也存在一定的缺陷，具體的取樣依據不夠完善[3]；檢測項目的篩查能力不足[4]。（ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）[5-9]能滿足獸藥多殘留的儀器檢測要求，而前處理就成為獸藥殘留檢測的關鍵步驟，（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe，QuEChERS）方法[10-14]用于獸藥殘留的前處理工作時，不僅保證前處理操作過程簡便、耗時短、有良好的凈化能力，還能保證方法的回收率、精密度。

因此，本研究通過QuEChERS結合UPLC-MS/MS建立同時測定水產品中14種獸藥殘留的檢測方法，完善水產品獸藥殘留的監控體系，同時也為獸藥殘留分析提供方法依據，從而建立適合現代檢測需求的快速、高效、綠色環保、成本低廉的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜串聯四級桿質譜儀（AB Triple Quad 6500四級桿質譜儀）：美國AB公司；Agilent 1290超高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；Wters BEH C18、Waters BEH HILIC色譜柱：美國Waters公司；Agilent Eclipse Plus C18RRHD色譜柱：美國安捷倫公司。

超純水：屈臣氏；乙腈、甲醇（色譜純）：德國默克公司；甲酸（ACS純）：美國西格瑪公司；C18填料、PSA 填料：天津博納艾杰爾科技有限公司；醋酸、無水硫酸鈉、無水硫酸鎂、醋酸鈉、氯化鈉（分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司。

標準物質（4-硝基咪唑、甲硝唑、地美硝唑、2-5-硝基咪唑、阿奇霉素、林可霉素、竹桃霉素、替米考星、紅霉素、泰樂菌素、吉他霉素、克拉霉素、羅紅霉素、螺旋霉素，所有藥物純度均大于99%）：德國Dr.Ehrenstorfer公司。

標準溶液的配制：準確稱量標準品，乙腈定容，分別配制濃度范圍在0.2 mg/mL～1 mg/mL之間的標準儲備單標；標準中間儲備液：將同一類藥物的標準儲備單標配制成一類藥物的中間液，乙腈定容，配制成10 μg/mL中間液后再稀釋成500 ng/mL中間液；混合標準工作液：用初始流動相對中間液進行稀釋，稀釋成所需濃度。標準溶液均為避光冷藏保存。

所需其他溶液：0.1%甲酸水溶液；0.1%甲酸-乙腈溶液；樣品提取溶液（5%醋酸-乙腈溶液）；樣品復溶液（初始流動相）。

1.2 樣品前處理

魚類取背脊部魚肉進行破碎，貝類、蝦類取可食用部分進行破碎，置于-18℃冰箱保存，稱取解凍恢復至室溫樣品2 g（精確到0.1 mg）置于50 mL離心管內，加入1 mL內標工作液、2 mL超純水，使樣品充分分散，加入10 mL 5%醋酸乙腈，同時加入4 g Na2SO4和1 g NaCl混勻，5 000 r/min，離心 5 min；移取上清液置于另一裝有150 mg C18、50 mg PSA（乙二胺-N-丙基填料，N-（N-propyl）ethylenediamine） 的 15 mL 離心管中，渦旋混勻使樣品與填料充分接觸，5 000 r/min離心5 min后移取6 mL上清液，上清液在35℃下氮吹至近干；用1 mL初始流動相復溶，過0.22 μm濾膜，待上機檢測。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱為 Waters BEH C18，1.7 μm，2.1mm×100 mm；流動相A為水、B為乙腈（均添加0.1%甲酸），洗脫程序見表1；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL。

1.3.2 質譜條件

正離子模式掃描（ESI+）；多反應監測采集方式（MRM）；霧化氣壓力及輔助氣壓力均為4.14×105Pa；氣簾氣壓力：2.07×105Pa；離子源溫度：550℃；電噴霧電壓：5 500 V；化合物的離子對參數、碰撞電壓、去簇電壓等參數見表2。

表2 14種化合物的質譜采集參數Table 2 Mass condition of 14 compounds

續表2 14種化合物的質譜采集參數Continue table 2 Mass condition of 14 compounds

圖1 14種組分混合標準溶液的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of 14 analytes mixed standard solution

2 結果與討論

2.1 色譜條件優化

色譜條件的優化旨在待測物之間的有效分離及目標化合物與雜質之間的有效分離。色譜柱考慮了Waters BEH HILIC、Agilent Eclipse Plus C18RRHD 及Waters BEH C18色譜柱，結果顯示，Waters BEH C18是本試驗發現效果較好的柱子。

有機相通常選擇甲醇、乙腈及甲醇與乙腈的混合物，乙腈與水混合對色譜柱能起到保護作用，而且乙腈有比甲醇強的洗脫能力，峰型好，柱效高等特點[15]，所以選擇乙腈作為有機相；化合物發生電離時，需要一定的陽離子為其提供質子來源，結果顯示，添加0.1%甲酸對化合物的分離效果最優，可以獲得尖且高的峰型，選擇分別在水相及有機相添加0.1%甲酸作為流動相。圖1為QuEChERS結合UPLC-MS/MS建立的方法所得出的（multi-reaction monitoring mode，MRM）譜圖。

2.2 前處理條件的優化

2.2.1 提取溶劑的優化

由于乙腈的提取效果優于甲醇、乙酸乙酯，且乙腈不會提取出較多的基質雜質[16]，因此選取乙腈為QuEChERS的提取溶劑；試驗中發現樣品隨著乙腈的加入而變的堅硬且成團，不利于待測化合物的提取，采用了先加水再用乙腈提取的方法；提取劑的酸度也需要優化，考慮了乙腈、1%醋酸乙腈、5%醋酸乙腈分別作為提取劑，結果顯示，5%醋酸乙腈為提取劑時，14種獸藥的平均回收率獲得了最優的結果。綜合考慮，選擇5%醋酸乙腈為本方法的提取溶劑，結果如圖2。

圖2 提取劑酸度的優化Fig.2 Effect of extraction solvent acidity

2.2.2 凈化條件的優化

凈化是去除提取溶液中雜質，利于后續的檢測工作[17]。鹽析的作用是去除蛋白質等基質雜質，常用的鹽析劑有NaAc和NaCl，吸水劑有MgSO4和Na2SO4，結果見圖3。

圖3 鹽析劑、吸水劑的選擇Fig.3 Choice of salting-out and absorbing agent

NaCl和Na2SO4組合時，硝基咪唑類及林可胺類化合物的均為最高，大環內酯類為次高，最后選擇NaCl和Na2SO4；QuEChERs技術是通過固相分散萃取技術對提取液進行凈化，即需要對雜質有較強的吸附能力，而對目標化合物的吸附能力較弱，常用的吸附劑主要有PSA、C18、中性氧化鋁，水產品中含有豐富的蛋白質、脂肪類物質，故本研究選取PSA、C18對水產品進行凈化；本試驗考慮了PSA、C18的不同使用量，結果如圖4。

圖4 吸附劑比例的優化Fig.4 Effect of adsorbent ratio

圖4結果表明，使用50 mg PSA+150 mg C18組合時，樣品溶液澄清，基質干擾較小，回收率顯著。

2.3 基質效應評價

在UPLC-MS/MS分析中，基質效應一般認為是與目標化合物共流出的雜質對目標化合物離子化過程的影響[18]，但基質效應是很難完全消除的。試驗最終采用基質匹配曲線來對樣品中的獸藥殘留進行定量，以抵消基質效應影響。

2.4 方法學驗證

2.4.1 基質曲線與檢測限

以沒有添加任何藥物的鯽魚為陰性樣品。以信噪比S/N≥10為LOQ，信噪比S/N≥3為LOD，求得14種化合物的相關系數均大于0.99，檢出限（limit of determination，LOD）和定量限（limit of quantity，LOQ）分別在 0.01 μg/kg～0.13 μg/kg和 0.02 μg/kg～0.44 μg/kg 范圍內，見表3。

表3 14種獸藥的定量限、檢出限、回歸方程、線性系數、回收率與相對標準偏差Table 3 Limit of detection（LODs），limit of quantitation（LOQs），regression equations，correlation coefficients，recoveries and RSDs of 14 veterinary drugs

續表3 14種獸藥的定量限、檢出限、回歸方程、線性系數、回收率與相對標準偏差Continue table 3 Limit of detection（LODs），limit of quantitation（LOQs），regression equations，correlation coefficients，recoveries and RSDs of 14 veterinary drugs

2.4.2 回收率與精密度

試驗中選取1、2、5 μg/kg 3個濃度水平進行添加，每個濃度重復6次平行測定，14種獸藥的回收情況為69.66%～97.25%，標準相對標準偏差為1.55%～10.06%，見表3。

2.5 實際樣品檢測

本試驗水產品樣品的采集依據SC/T 3016-2004《中華人民共和國水產行業標準》進行采樣。樣品主要為天津地區養殖水產品，樣品包括淡水魚斑點叉尾鮰、大鱗鲃、加州鱸魚、鯉魚、花鰱魚、草魚；海水魚點帶石斑魚、珍珠龍膽石斑魚、半滑舌鰨、大菱鲆；貝類為菲律賓蛤仔、毛蚶；蝦類為南美白對蝦。天津地區養殖水產品中14種獸藥均未檢出。

3 結論

本試驗通過QuEChERs結合UPLC-MS/MS對14種獸藥進行檢測，采用5%醋酸乙腈提取，PSA、C18凈化，水：乙腈（均含有0.1%甲酸）為流動相，Waters BEH C18，1.7 μm為色譜柱，建立了UPLC-MS/MS同時測定水產品中14種獸藥殘留的分析檢測方法。本方法試驗檢測周期短、前處理方法簡單，無需特殊實驗裝置，且試驗成本低，為大批量水產品獸藥殘留檢測提供了簡便可靠的方法。