共振散射光譜法測(cè)定牛奶中的四環(huán)素

唐寧莉，范晶晶，馬小龍，王文平，單展

（1.桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西桂林541004；2.桂林理工大學(xué)廣西高校食品安全與檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林541004；3.桂林理工大學(xué)電磁化學(xué)功能物質(zhì)廣西區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林541004）

四環(huán)素類抗生素是一種由鏈霉素產(chǎn)生的廣譜抗生素。由于它可以預(yù)防和治療傳染病、提高飼料效率、加快動(dòng)物的生長(zhǎng)速度，所以在畜牧業(yè)中得到廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，四環(huán)素主要作為一種獸藥和飼料添加劑用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，其用量逐年增加。但是四環(huán)素不能完全被人和動(dòng)物所吸收，大約攝入量的75%會(huì)通過(guò)尿液和糞便排泄出來(lái)[1]，未經(jīng)適當(dāng)預(yù)處理的四環(huán)素進(jìn)入水環(huán)境和土壤中，容易造成環(huán)境問(wèn)題，包括生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)和抑制水生、陸生生物的生長(zhǎng)。食品中殘留的四環(huán)素會(huì)造成一些非致病菌的死亡，使菌群失調(diào)，抑制有益菌的生長(zhǎng)，為一些致病菌提供生存空間[2]，對(duì)人類健康造成不良影響。隨著社會(huì)的進(jìn)步，人們對(duì)食品安全越來(lái)越重視，牛奶是所有年齡階層的人們生活中不可或缺的營(yíng)養(yǎng)品。但在奶牛的飼養(yǎng)過(guò)程中，四環(huán)素常用作飼料添加劑及防治奶牛的乳腺炎，從而導(dǎo)致牛奶中可能有四環(huán)素殘留。因此，建立一種快速、靈敏地檢測(cè)牛奶中痕量四環(huán)素的方法至關(guān)重要。目前，測(cè)定四環(huán)素的主要方法有微生物法[3-4]、免疫學(xué)快速檢測(cè)法[5-7]、高效液相色譜法[8-12]、表面拉曼光譜法[13]、酶聯(lián)免疫吸附法[14-15]、紫外-可見(jiàn)分光光度法[16-18]、熒光光度法[19-21]、電化學(xué)法[22-23]、共振散射法[24]等。

共振光散射的概念是1979年由Anglister等[25-26]提出并推導(dǎo)出了共振散射強(qiáng)度與被測(cè)物濃度的定量關(guān)系式。光散射是指當(dāng)一束光通過(guò)介質(zhì)時(shí)在入射光以外的方向上觀測(cè)到光強(qiáng)的現(xiàn)象。當(dāng)介質(zhì)中的粒子直徑遠(yuǎn)小于入射光波長(zhǎng)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生以Rayleigh（瑞利）散射為主的分子散射。當(dāng)瑞利散射位于或接近它的吸收帶時(shí)，由于分子吸收電磁波的頻率與其散射頻率相同，分子因共振而強(qiáng)烈吸收散射光的能量發(fā)生再次散射，其散射強(qiáng)度通常較單一的瑞利散射提高幾個(gè)數(shù)量級(jí)，不再遵守散射強(qiáng)度與波長(zhǎng)的四次方成正比的散射定律。這種吸收-再散射的過(guò)程稱為共振瑞利散射，又叫共振散射。1993年，美國(guó)科學(xué)家Pastermack等使用熒光光度計(jì)獲得了一種共振散射光譜，并首次將共振散射技術(shù)用于研究卟啉類化合物[27]。由于共振散射光譜法具有操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、選擇性好、成本低等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)金屬離子、蛋白質(zhì)、食品及小分子藥物等。但是，目前利用共振散射光譜法檢測(cè)四環(huán)素的研究較少。利用四環(huán)素分子中的β-二酮結(jié)構(gòu)與Co2+形成二元陽(yáng)離子，然后再與帶負(fù)電的鋁試劑通過(guò)靜電引力作用形成三元離子締合物，從而改變反應(yīng)前后體系的共振散射強(qiáng)度，建立一種快速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)牛奶中四環(huán)素的共振散射光譜法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液（tetracycline，Tc，90%）：美國(guó)Amresco公司；1.0×10-3mol/L的Tc儲(chǔ)備液，由儲(chǔ)備液稀釋得到1.0×10-4mol/L的Tc工作液；Co2+溶液（由氯化鈷配制成1.0×10-2mol/L）：上海試劑二廠；鋁試劑溶液（aurin tricarboxylic acid，ATA，1.0×10-3mol/L）：新中化學(xué)廠；HCl、H2SO4、HAc（1.0×10-5mol/L）溶液：廣東汕頭市西隴化工股份有限公司。

試驗(yàn)所用試劑均為分析純，用水均為二次去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

F-7000熒光光度計(jì)：日本津島；pHS-3C精密pH計(jì)：上海雷磁儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理[28]

準(zhǔn)確量取5.0 mL牛奶樣品（購(gòu)買于當(dāng)?shù)啬吵械拿膳！⒁晾兣Ｄ蹋┯?00 mL離心管中，加入50 mL pH 5.0的乙酸鈉緩沖液-乙腈混合溶液（體積比1∶4），超聲5 min，5 000 r/min離心20 min除去蛋白質(zhì)。然后取上清液于分液漏斗中，加入25mL正己烷，超聲5min，靜置分層后棄去正己烷層。吸取下層清液，用正已烷反復(fù)脫脂至澄清，得樣品待測(cè)液。

1.3.2 四環(huán)素濃度的測(cè)定

考慮到試驗(yàn)條件對(duì)測(cè)定結(jié)果有一定的影響，進(jìn)行了反應(yīng)介質(zhì)及用量、氯化鈷用量、鋁試劑加入量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間幾個(gè)單因素試驗(yàn)，選擇最佳試驗(yàn)條件測(cè)定四環(huán)素濃度。

在10 mL的具塞比色管中，分別加入0.5 mL 1.0×10-5mol/L HCl溶液，1.5 mL 1.0×10-2mol/L Co2+溶液，2.0 mL 1.0×10-3mol/L ATA溶液和一定量的Tc工作液（以不加Tc的溶液為試劑空白），加水稀釋至10 mL，搖勻，室溫反應(yīng)30 min后，在熒光光度計(jì)上以激發(fā)波長(zhǎng)等于發(fā)射波長(zhǎng)（λex=λem）的方式進(jìn)行同步掃描，記錄波長(zhǎng)401.8 nm處有四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液的共振散射強(qiáng)度I和試劑空白的共振散射強(qiáng)度I0，并計(jì)算共振散射強(qiáng)度差值ΔI=I-I0。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析及圖形繪制采用origin軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 體系的共振散射光譜

依照試驗(yàn)方法掃描了體系的共振散射光譜，結(jié)果如圖1所示。

圖1 體系的共振散射光譜Fig.1 Resonance light scattering spectra of the systems

在 HCl溶液中，Co2+、ATA、Tc的兩兩反應(yīng)產(chǎn)物（圖1曲線1～3）的共振散射強(qiáng)度都較弱，但當(dāng)三者共存時(shí)，體系的共振散射強(qiáng)度隨Tc濃度的增大而增強(qiáng)（圖1曲線4和5），并且在401.8 nm處具有最強(qiáng)的共振散射峰，由此可見(jiàn)Co2+、ATA、Tc三者反應(yīng)生成三元離子締合物后使體系的共振散射強(qiáng)度增強(qiáng)。

2.2 試驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.2.1 反應(yīng)介質(zhì)及其用量

分別考察了 HCl、H2SO4、HAc 3種溶液對(duì)反應(yīng)體系的影響（見(jiàn)圖2）。

圖2 不同介質(zhì)對(duì)體系的影響Fig.2 Effect of different medium on system

由圖2可知，體系在不同介質(zhì)中的共振散射強(qiáng)度差值（ΔI）不同，在HCl溶液中體系的 ΔI值較大，且較為穩(wěn)定，所以選擇HCl溶液作為反應(yīng)介質(zhì)。向體系中加入不同體積的稀HCl溶液，結(jié)果表明：當(dāng)HCl用量為0.1 mL～0.5 mL時(shí)，隨HCl用量的增大，四環(huán)素與Co2+形成的螯合陽(yáng)離子逐漸增多，該陽(yáng)離子與帶負(fù)電的鋁試劑形成的三元離子締合物也逐漸增多，因此ΔI逐漸增大；當(dāng)HCl用量為0.5 mL時(shí)，反應(yīng)基本完全，ΔI值最大，靈敏度最高，故選擇1.0×10-5mol/L的HCl最佳用量為0.5 mL。

2.2.2 氯化鈷用量

試驗(yàn)加入了不同體積的氯化鈷溶液時(shí)體系的反應(yīng)情況，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 氯化鈷用量的影響Fig.3 Effect of the volume of Co2+

由圖3可知，當(dāng)Co2+的用量在0.6 mL～1.5 mL之間，ΔI值隨Co2+用量的增加而增大，用量超過(guò)1.5 mL后，體系的ΔI值隨著Co2+用量的增加而減小，為了保證四環(huán)素Tc與Co2+能充分反應(yīng)，所以選擇氯化鈷用量為1.5 mL。

2.2.3 鋁試劑用量

加入不同體積的鋁試劑時(shí)，體系的△I值會(huì)有相應(yīng)的變化，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 鋁試劑用量的影響Fig.4 Effect of the volume of ATA

由圖4可知，當(dāng)1.0×10-3mol/L ATA的用量為1.5 mL～2.0 mL時(shí)，體系的ΔI值隨鋁試劑用量的增大而增大；當(dāng)ATA的用量為2.0 mL～2.8 mL時(shí)，體系的ΔI值隨鋁試劑用量的增大而減小，故選擇1.0×10-3mol/L ATA的用量為2.0 mL。

2.2.4 反應(yīng)溫度的選擇

試驗(yàn)了不同反應(yīng)溫度對(duì)體系ΔI值的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知，當(dāng)反應(yīng)溫度在5℃～20℃時(shí)，隨溫度升高，體系的ΔI值逐漸增大；當(dāng)反應(yīng)溫度為20℃～30℃時(shí)，體系的ΔI值變化不大；當(dāng)繼續(xù)升溫后發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，體系的ΔI值不斷下降。因此，為了方便操作，選擇在25℃（即室溫）下進(jìn)行反應(yīng)。

2.2.5 反應(yīng)時(shí)間的選擇

反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系△I值的變化也有一定的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖5 反應(yīng)溫度的影響Fig.5 Effect of reaction temperature

圖6 反應(yīng)時(shí)間的影響Fig.6 Effect of reaction time

如圖6所示，當(dāng)體系反應(yīng)時(shí)間在5 min～30 min時(shí)，體系的ΔI值隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增大；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為30 min時(shí)，ΔI值達(dá)到最大；反應(yīng)30 min后，體系的ΔI值略有降低，所以選擇體系的反應(yīng)時(shí)間為30 min。

2.3 工作曲線及方法的檢出限

在最優(yōu)試驗(yàn)條件下，測(cè)定不同濃度Tc標(biāo)準(zhǔn)溶液的I，并繪制對(duì)應(yīng)ΔI值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7結(jié)果表明，Tc濃度在2.0×10-7mol/L～1.5×10-5mol/L范圍內(nèi)與體系的ΔI值存在良好的線性關(guān)系。線性回歸方程為：ΔI=1.247×107c+16.44（c為 Tc的濃度，單位mol/L），相關(guān)系數(shù)為0.997 1。平行測(cè)定13次試劑空白，標(biāo)準(zhǔn)偏差（s）為0.20，計(jì)算出檢出限為4.81×10-8mol/L（DL=3S/K，式中：DL 表示檢出限，S 表示標(biāo)準(zhǔn)偏差，K表示線性回歸方程的斜率）。

圖7 Tc的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Calibration curve of Tc

2.4 共存物質(zhì)的影響

在優(yōu)化的反應(yīng)條件下，考察了可能存在干擾的物質(zhì)對(duì)1.0×10-5mol/L四環(huán)素（Tc）標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定的影響，當(dāng)相對(duì)誤差在±5%以內(nèi)時(shí)，共存物質(zhì)的允許量（以倍數(shù)計(jì)）如下：蔗糖（158）；葡萄糖（140）；NO3-（80）；Na+、K+（60）；EDTA、SO42-（50）；Mg2+、NH4+（30）；甘氨酸（20）；L-天冬氨酸（12）；DL-半胱氨酸、L-酪氨酸（9）；L-精氨酸（4.7）；Fe3+（1.7）；Fe2+（0.8）。

2.5 樣品測(cè)定

取一定體積的樣品待測(cè)液按照試驗(yàn)方法測(cè)定，均未檢出四環(huán)素。為考察試驗(yàn)方法的可行性，做了加標(biāo)回收試驗(yàn)，如表1所示。

表1 樣品和回收率分析結(jié)果（n=5）Table 1 Analytical results of samples and recovery（n=5）

由表1可知本方法的加標(biāo)回收率在99.28%～101.70%之間。

3 結(jié)論

在酸性條件下，四環(huán)素與Co2+形成的螯合陽(yáng)離子與帶負(fù)電的鋁試劑通過(guò)靜電引力形成三元離子締合物，使體系在401.8 nm處的共振散射強(qiáng)度增強(qiáng)，且四環(huán)素濃度在2.0×10-7mol/L～1.5×10-5mol/L范圍內(nèi)與共振散射強(qiáng)度增加值存在良好的線性關(guān)系。通過(guò)優(yōu)化體系的反應(yīng)條件，建立了定量檢測(cè)四環(huán)素的共振散射光譜法，方法的靈敏度較高，檢出限為4.81×10-8mol/L，且操作簡(jiǎn)便、快速，可用于測(cè)定牛奶樣品中四環(huán)素的殘留量。