保寧醋醋曲中醋酸菌篩選及其代謝產(chǎn)物分析

劉陽，鄧靜，吳華昌

（四川旅游學(xué)院，四川成都610100）

保寧醋是我國四大傳統(tǒng)名醋之一，采用白叩、砂仁、杜仲、當(dāng)歸、五味、薄荷等60多種中草藥制曲釀造，使其具有獨特的中草藥香味，色澤鮮亮、酸味柔和適中、醇香回甜、經(jīng)久不腐，成為我國傳統(tǒng)藥醋的典型代表[1-2]。

食醋釀造中的產(chǎn)酸微生物種類繁多，醋酸菌可在醋酸發(fā)酵階段將大量的酒精轉(zhuǎn)化為乙酸，提高產(chǎn)酸量及出醋率。目前在保寧醋釀造研究中，多涉及醋醅中醋酸菌、乳酸菌的分離、產(chǎn)酸能力方面，關(guān)于保寧醋固態(tài)釀造醋曲中醋酸菌的分離、鑒定及應(yīng)用研究較少。

本研究采用可培養(yǎng)的方法從保寧醋醋曲中分離產(chǎn)酸微生物，以產(chǎn)酸量、耐酒精能力、耐酸能力為指標(biāo)篩選醋酸菌，以生理生化試驗和16SrDNA相結(jié)合進行菌株鑒定，并對其代謝產(chǎn)物進一步分析，探究其在保寧醋發(fā)酵過程中的發(fā)揮作用，對保寧醋生產(chǎn)和發(fā)酵工藝的改良具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料來源

保寧醋醋曲：四川省保寧醋有限公司。

1.1.2 儀器設(shè)備

SHP0201147047電子分析天平：上海恒平科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-IF超凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海深諳醫(yī)療器械廠；BH200微生物顯微鏡：寧波舜宇儀器有限公司：S-3C pH計：成都世紀(jì)方舟科技有限公司；DY-6C電泳儀：北京市六一儀器廠；S1000PCR擴增儀、GelDoc 2000紫外凝膠成像儀：美國Bio-Rad公司；7890A-5975B氣相色譜質(zhì)譜、Agilent 1200高效液相色譜：美國Agilent公司。

1.1.3 主要試劑

葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、硫酸銨、硫酸鎂、瓊脂粉、氯化鈣、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠；DL2000 DNA Marker、rTaq酶、dNTP 等聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）相關(guān)試劑：大連寶生物有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

醋酸菌基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖1%、酵母膏1%、pH 4.5，121℃滅菌20 min，使用前加入3.0%（體積分?jǐn)?shù)）95%乙醇。

分離培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中瓊脂2%，碳酸鈣2%。

醋酸菌斜面保藏培養(yǎng)基：葡萄糖1%、酵母膏1%、磷酸氫二鉀0.05%、硫酸鎂0.05%、瓊脂2%，分裝試管，121℃滅菌20 min后加入3.0%（體積分?jǐn)?shù)）95%乙醇，擺成斜面即可。

1.2 方法

1.2.1 醋酸菌的分離

樣品預(yù)處理：稱取10 g醋曲樣品于裝有30 mL ddH2O的離心管中，渦旋均勻，4層紗布過濾后備用；

富集培養(yǎng)及稀釋涂布：取2 mL過濾菌液加入已滅菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，28℃，150 r/min搖床培養(yǎng)24小時后，取1.0 mL菌液于盛有9 mL 0.85%生理鹽水的試管中，依次用已滅菌0.85%生理鹽水稀釋，獲得最終濃度為10-3～10-5的稀釋液，每個稀釋度吸取100 μL稀釋液涂布于分離培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)2 d～3 d；

式中：V為發(fā)酵液樣品滴定耗用的NaOH體積，mL；V0為空白培養(yǎng)基為對照滴定耗用的NaOH體積，mL；CNaOH為 NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；60 為乙酸的相對分子質(zhì)量；V樣為樣品液體積，mL。

1.2.2.3 醋酸菌的耐酒精能力比較[5]

分別挑取一環(huán)菌種接種于液體基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、120 r/min培養(yǎng)12小時后活化菌種，向液體基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加酒精使其終濃度為3%、5%、7%、9%、11%，再以2%的接種量接種于已添加酒精的液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30℃、120 r/min培養(yǎng)24 h，在波長600 nm下測定發(fā)酵液吸光度。

1.2.2.4 醋酸菌的耐酸能力比較

與醋酸菌耐酒精試驗操作相同，其中活化后的菌種以 2%接種于具有不同 pH 值（2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）的液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。

1.2.3 產(chǎn)酸菌的鑒定

產(chǎn)酸菌的生理生化鑒定：參考《伯杰明細(xì)菌手冊》進行生理生化試驗。

DNA提取：參考吉志偉等[6]的方法，提取DNA。

PCR擴增：采用引物27F/1492r對醋酸菌和乳酸菌的16SrDNA區(qū)進行特異性擴增，其PCR擴增體系參考文獻[7]。測序結(jié)果經(jīng)BLAST同源性比對后，在Mega6.0軟件中采用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育

純化及保藏：挑取透明圈較大的菌株，劃線純化2次～3次，鏡檢后接種于斜面試管進行短期保藏，采用甘油保藏法進行長期保藏。

1.2.2 醋酸菌篩選

1.2.2.1 醋酸菌的定性試驗[3]

挑取兩環(huán)醋酸菌菌種接種于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、120 r/min搖床培養(yǎng)2 d～3 d。取10 mL培養(yǎng)液于離心管中，5 000 r/min離心10 min，去菌體。取5 mL無菌培養(yǎng)液，煮沸后，以0.1 mol/L氫氧化鈉溶液中和至pH 7.0，滴加5%氯化鐵3滴～5滴，產(chǎn)生紅褐色沉淀者為醋酸菌，以未接種基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對照。

1.2.2.2 醋酸菌的產(chǎn)酸量測定[4]

挑取醋酸菌菌種接種于30 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、120 r/min搖床培養(yǎng)12 h，以2%接種量接種于30 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基 [添加7%（體積分?jǐn)?shù)）95%乙醇]，再次培養(yǎng)3 d，取1 mL發(fā)酵液加入裝有20 mL蒸餾水的錐形瓶中，滴加2滴酚酞指示劑，搖勻后用滴定法測定產(chǎn)酸量，每株菌株3個平行，以未接種基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對照，產(chǎn)酸量計算見公式（1）。樹，進行同源性分析。

1.2.4 發(fā)酵液的揮發(fā)性物質(zhì)分析

將初篩菌株接種于50 mL液體基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃，120 r/min培養(yǎng)5 d，以未接種基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)為空白對照，準(zhǔn)確量取7 mL發(fā)酵液于15 mL頂空瓶中恒溫（65℃）水浴，將50/30 μmDVB/CAR/PDMS萃取頭插入頂空瓶中平衡10分鐘后吸附30 min（在固相微萃取裝置上實現(xiàn)）后，將萃取頭移入氣相色譜的高溫汽化室中解吸5 min，進行GC-MS分析。

色譜條件：毛細(xì)管色譜柱Agilent HP-INNOWax（60 m×250 μm，0.25 μm）；手動無分流進樣，進樣口溫度230℃；程序升溫45℃，保留3 min，以10℃/min的速率升至200℃，保留5 min；檢測器溫度230℃；載氣He，流速 1 mL/min。

質(zhì)譜條件：EI電離源，電子能量70 eV，掃描范圍10 u～550 u，離子源溫度230℃；接口溫度230℃。

1.2.5 發(fā)酵液的有機酸分析

發(fā)酵液前處理：取10 mL發(fā)酵液，5 000 r/min離心20 min，準(zhǔn)確量取5 mL上清液于100 mL容量瓶中，分別加入2 mL 10.6%亞鐵氰化鉀（需要避光保存）和2 mL 30%硫酸鋅，搖勻后用ddH2O定容。室溫下靜止沉淀30 min，取澄清液5 000 r/min離心20 min后，取上清液，上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液采用HPLC進行有機酸分析[8]。

液相系統(tǒng)：Agilent1200；Gemini色譜柱：C184.6 mm×250 mm，5 μm；流動相：（NH4）2HPO4/甲醇=95/5，pH 2.7；進樣體積：20 μL；流動速度：0.4mL/min；柱溫：20℃；檢測器：UV 210 nm。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確配制6種有機酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度見表1。

表1 有機酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度Table 1 Concentrations of mixed standards solution for organic acid

分別取不同體積（1.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，以ddH2O定容，配制不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

有機酸的定性、定量分析：以保留時間和樣品加標(biāo)定性，將不同濃度的有機酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在同樣的色譜條件下進樣，以有機酸濃度為橫坐標(biāo)（mg/mL），有機酸峰面積（mV）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用峰面積外標(biāo)法定量，得到不同有機酸的線性范圍、回歸方程及相關(guān)系數(shù)。有機酸計算見公式2。

式中：C為醋醅中有機酸含量，g/100 g干醅；C樣為由有機酸標(biāo)準(zhǔn)曲線所得有機酸濃度，mg/mL；N為樣品稀釋倍數(shù)；W為醋醅質(zhì)量，g；M為醋醅水分含量，%。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋酸菌的篩選

2.1.1 醋酸菌的定性試驗

根據(jù)碳酸鈣透明圈的大小及菌落形態(tài)差異，從分離培養(yǎng)基上得到產(chǎn)生透明圈的15株醋酸菌，分別命名為A1～A15，并對15株產(chǎn)酸菌進行醋酸菌定性試驗，取一定量的醋酸菌發(fā)酵液，離心后進行醋酸菌的定性試驗，其結(jié)果如表2所示。

表2 醋酸菌定性試驗Table 2 The qualitative test of acetic acid bacteria

如表2知，除空白組、菌株A7、A14以外，均可產(chǎn)生磚紅色沉淀且沉淀含量有所差異，所以，13株產(chǎn)酸菌初步鑒定為醋酸菌，進一步對13株菌株進行產(chǎn)酸量測定。

2.1.2 醋酸菌的產(chǎn)酸量測定

采用滴定法測定13株醋酸菌發(fā)酵液中總酸含量，其結(jié)果如圖1所示。

圖1 醋酸菌的總酸含量Fig.1 The total acid content of acetic acid bacteria strains

由圖1可知，12株醋酸菌的產(chǎn)酸量均在8.00 g/L以上，菌株A12的產(chǎn)酸量最低，僅為5.65 g/L，產(chǎn)酸量較高的為菌株 A11、A9、A10、A5，其中 A11 的產(chǎn)酸量最高，達到 30.90 g/L。故選用 A11、A9、A10、A5 進行后期試驗。

2.1.3 醋酸菌的耐性試驗

醋酸菌菌株在不同酒精濃度和pH值的液體基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時后，在波長600 nm處測定發(fā)酵液的吸光度。分別以酒精濃度和pH值為橫坐標(biāo)，以發(fā)酵液吸光度為縱坐標(biāo)，繪制醋酸菌的耐性曲線，其曲線如圖2所示。

圖2 醋酸菌耐性試驗Fig.2 The resistant test of acetic acid bacteria

由圖2可知，隨著培養(yǎng)基中酒精濃度的逐漸增加，菌株 A5、A9、A10、A11發(fā)酵液在 600 nm 處的吸光度均呈現(xiàn)下降趨勢，在酒精濃度為3%時，4株醋酸菌的吸光度大致相同，無明顯差異，在酒精濃度由5%增加至9%時，菌株A5、A9、A10發(fā)酵液的吸光度迅速下降至0.4附近，菌株A11也呈現(xiàn)下降趨勢，相對于其余3株而言，其下降趨勢更為緩和。在接種量相同的情況下，以總趨勢來說，菌株A11在5個不同的酒精濃度下，其發(fā)酵液的吸光度均高于其他3株醋酸菌，表明菌株A11的耐酒精能力均高于其他三株菌。

隨pH值的不斷增加，4株醋酸菌發(fā)酵液的吸光度呈上升趨勢，在pH值為2.5～4.0之間時，4株醋酸菌的發(fā)酵液的吸光度均出現(xiàn)明顯的增加，在pH值為3.0～4.0時，菌株A5、A9、A10發(fā)酵液吸光度隨pH值變化最為明顯，菌株A11的變化趨勢更為平緩。菌株A11在pH值為3.0～3.5時變化最明顯，在pH值為3.5后，變化趨勢逐漸平緩，且在不同的pH值下，菌株A11發(fā)酵液的吸光度均高于其他3株醋酸菌，表明菌株A11的耐酸能力強于其他3株醋酸菌。

2.2 生理生化鑒定及16SrDNA分子鑒定

2.2.1 A11的生理生化鑒定

將菌株A11接種于醋酸菌分離培養(yǎng)基，觀察其菌落形態(tài)，通過革蘭氏染色觀察其個體形態(tài)，對其進行部分生理生化試驗。其菌落形態(tài)及個體形態(tài)結(jié)果如圖3所示。

圖3 醋酸菌的菌落形態(tài)和個體形態(tài)Fig.3 The colony morphology and individual morphology of acetic acid bacteria

如圖3所示，醋酸菌A11的菌落形態(tài)為：乳白色稍黃，圓形或橢圓，菌落較小，邊緣整齊，不透明，濕潤有光澤，易挑起。其在100倍油鏡下的個體形態(tài)為：粉紅色，短桿狀，單生或少數(shù)對生。其生理生化試驗如表3所示，參考《伯杰明細(xì)菌手冊》，可將該菌株初步歸為醋桿菌屬。

表3 醋酸菌的生理生化鑒定Table 3 Physiological and biochemical identification of acetic acid bacteria

2.2.2 A11的16SrDNA分子鑒定

以醋酸菌A11的DNA為模板，27F/1492r為引物，進行PCR擴增，其擴增產(chǎn)物以1%的瓊脂糖電泳檢測，其擴增結(jié)果如圖4所示。并送往上海杰李生物有限公司測序，BLAST基因比對后，采用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化發(fā)育樹，結(jié)果如圖5所示。

如圖5所示，菌株A11與醋酸桿菌（Acetobacter sicerae LMG 1531）在發(fā)育樹的同一分支上，同源性達到99%，故可認(rèn)為菌株A11為醋酸桿菌（Acetobacter sicerae）。

2.3 醋酸菌代謝產(chǎn)物分析

2.3.1 醋酸菌A11發(fā)酵液中揮發(fā)性物質(zhì)分析

采用HS-SPME-GC-MS法檢測醋酸菌發(fā)酵液中的揮發(fā)性成分種類及相對含量，圖6、圖7分別為接種醋酸菌發(fā)酵前和醋酸菌發(fā)酵結(jié)束后揮發(fā)性物質(zhì)檢測結(jié)果，空白培養(yǎng)基和發(fā)酵液揮發(fā)性成分見表4。

圖4PCR擴增電泳圖Fig.4 The amplification electrophoresis pattern of A11

圖5 A11系統(tǒng)發(fā)育樹示意圖Fig.5 The phylogenetic tree of the strain A11

圖6 空白培養(yǎng)基的總離子流圖Fig.6 The ion-flow graph of blank fermentation broth

圖7 醋酸菌A11發(fā)酵液的總離子流圖Fig.7 The ion-flow graph of the fermentation broth of acetic acid bacteria A11

表4 醋酸菌A11發(fā)酵液中揮發(fā)性成分Table 4 Volatile components of the fermentation broth of acetic acid bacteria A11

表4中空白培養(yǎng)基和A11發(fā)酵液分別檢測出8種和10種物質(zhì)，其中空白培養(yǎng)基中，主要成分為乙醇，其相對含量為91.79%，為A11發(fā)酵酸化提供原料；在A11發(fā)酵液中，共生成7種新代謝產(chǎn)物，分別為乙醛、3-羥基-2-丁酮、乙酸、乙酸銨、芳樟醇、S-（Z）-3，7，11-三甲基-1，6，10-十二烷三烯-3-醇、橙花叔醇。其中3-羥基-2-丁酮具有水果香、奶油香，常用于奶香、草莓香等香精的制備及直接添加使用[9]，同時也是四甲基吡嗪的重要的前提物質(zhì)[10]。除此之外，發(fā)酵液中乙醛的相對含量較低，僅為0.388%，但低濃度的乙醛溶液具有愉快的青蘋果香味[11]，是重要的呈感官特征的醛類化合物。A11發(fā)酵液中，主要的揮發(fā)性物質(zhì)為乙醇和乙酸，其相對含量分別為52.659%、39.25%，相比空白培養(yǎng)基而言，乙醇相對含量從91.79%降至52.659%，其乙酸相對含量增加了39.25%。表明醋酸菌A11將大量乙醇轉(zhuǎn)化為乙酸。同時甲氧基苯基肟、2，4-二叔丁基苯酚相對含量均有所增加。

2.3.2 發(fā)酵液中有機酸分析

制定有機酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別精確稱取6種有機酸，配制有機酸混標(biāo)溶液，并分別制備不同濃度的混標(biāo)溶液，進樣分析，以有機酸含量X（mg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積Y（mV）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程，有機酸色譜圖和線性方程如圖8和表5所示。

圖8 有機酸標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.8 The chromatogram of standard organic acid

表5 有機酸的回歸曲線及相關(guān)系數(shù)Table 5 Regression curve and correlation coefficient of organic acids

由圖8可知，在該色譜條件下，6種有機酸可完全分離，表明該色譜條件可用于分離有機酸。由表5可知，6種有機酸標(biāo)準(zhǔn)品的回歸相關(guān)性良好，可用于有機酸的定量分析。

醋酸菌A11發(fā)酵液中有機酸的分析：采用高效液相色譜法檢測醋酸菌發(fā)酵液中的有機酸的種類及相對含量，其結(jié)果如圖9、表6所示。

由表6知，對A11菌株的發(fā)酵液進行6種有機酸的測定，發(fā)現(xiàn)醋酸菌A11發(fā)酵液中只檢測到兩種有機酸，分別為乙酸、檸檬酸其保留時間分別為乙酸11.412 min，檸檬酸14.406 min。A11液態(tài)發(fā)酵主要生成大量的乙酸，其產(chǎn)量達到542.88 mg/100 mL，檸檬酸產(chǎn)量為17.21 mg/100 mL。

圖9 醋酸菌A11發(fā)酵液中有機酸色譜圖Fig.9 The organic acid chromatogram of the fermentation broth of acetic acid bacteria strain A11

表6 發(fā)酵液中有機酸檢測Table 6 Detection of organic acid in the fermentation broth

3 結(jié)論

從保寧醋醋曲中篩選到13株醋酸菌，通過定性、產(chǎn)酸量、耐酒精能力、耐酸能力試驗，篩得一株產(chǎn)酸量為30.90 g/L的醋酸菌，其耐酸和耐酒精能力均優(yōu)于其他菌株。經(jīng)生理生化試驗及16SrDNA試驗鑒定其為醋酸桿菌（Acetobacter sicerae）。采用固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法和高效液相色譜法分析醋酸菌A11發(fā)酵液中的風(fēng)味物質(zhì)和有機酸含量，醋酸菌A11主要是將乙醇轉(zhuǎn)化成乙酸，其他揮發(fā)性物質(zhì)較少，相對含量不高，有機酸共檢測到乙酸和檸檬酸，其乙酸含量可高達542.88 mg/100 mL。醋酸菌在食醋發(fā)酵過程中發(fā)揮重要作用，而此次所得醋酸桿菌產(chǎn)酸能力突出，其對保寧醋工業(yè)生產(chǎn)和發(fā)酵工藝的改良具有指導(dǎo)意義。