北京棒桿菌E31天冬氨酸激酶突變體T361D酶學性質表征

陳晨，閔偉紅，張芷睿，方麗

（吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春130118）

天冬氨酸代謝途徑能夠催化生成蘇氨酸、賴氨酸和甲硫氨酸，這3種氨基酸為人類及動物體內的必需氨基酸，不能依靠自身合成，只能從食物中獲取[1-2]。目前，這幾種氨基酸在醫藥、食品，保健等方面都有廣泛的應用，主要依靠化學合成法和微生物發酵法進行氨基酸生產，其中，化學合成法的工藝復雜，合成過程中含有毒害物質，且產物多為D、L-型混旋體，而微生物發酵法大多為微生物在合適營養環境下自發，氨基酸產物無污染。但微生物在發酵過程中，具有嚴密的調節機制，若大量生產氨基酸，需打破部分代謝調控機制[3]。

在天冬氨酸族氨基酸的代謝途徑中，天冬氨酸激酶（aspartate kinase，AK）作為第一關鍵酶[4]對整體途徑具有非常重要的調控作用[5]，其催化天冬氨酸產生蘇氨酸、賴氨酸和甲硫氨酸但同時又受賴氨酸和蘇氨酸兩種代謝產物的協同反饋抑制[6]，因此限制了天冬氨酸族氨基酸的產量。如何打破二者對其的反饋抑制作用，從而使末端氨基酸大量積累，具有重要的研究意義[7-9]。

通過天冬氨酸激酶的基因序列比對，證明北京棒桿菌天冬氨酸激酶（AKfromCorynebacteriumpekinense，CpAK）與谷氨酸棒桿菌天冬氨酸激酶（AK from Corynebacterium glutamicum，CgAK） 的同源性高達99.58%，且反饋抑制機制相似[10]。并且確定北京棒桿菌T361為保守位點。因此本研究以蛋白質數據庫（protein data bank，PDB）中CgAK晶體結構（代碼：3aaw）[11]為模板對CpAK T361位點進行飽和定點突變，采用高通量篩選技術選擇酶活力提高明顯的T361D突變株，研究T361D AK的酶動力學及酶學性質，為減弱或解除抑制劑對酶活力的反饋抑制作用與構建天冬氨酸族氨基酸基因工程菌提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

北京棒桿菌C.pekinense E31：吉林農業大學發酵工程實驗室保存，其AK基因連接在pET-28a質粒上。

1.1.2 培養基

溶菌肉湯（Luria-Bertani，LB）培養基[12]（含50μg/mL卡那霉素）：Genview公司。

1.1.3 試劑

PCR試劑盒、質粒抽提試劑盒、電泳Marker、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠試劑盒：大連TaKaRa公司；卡那霉素、異丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG）：Genview公司。

1.1.4 主要儀器

酶標儀（infinitieM200）：TECAN 公司；蛋白電泳儀（SE260）：GE Healthcare Bio-Sciences AB 公司；超聲波破碎儀（Scientz-ⅡD）：寧波新芝生物科技有限公司；高速冷凍離心機（Z36HK）：德國HERMLE公司；PCR儀（AG）：eppendorf中國有限公司。

1.2 飽和突變引物設計

運用軟件Primer Premier 5對T361位點進行引物設計后送至上海生工生物公司進行合成，引物設計如下（引物中劃線部分NNN為突變位點）：

1.3 重組質粒pET-28a-AK提取及定點突變

參照質粒提取試劑盒中說明進行重組質粒pET-28a-AK的提取，以重組質粒為模板進行突變PCR后用于0.1%瓊脂糖凝膠核酸電泳驗證[13]，并將驗證成功后的產物進行消化。

1.4 消化產物轉化

將1.2 μL消化后的產物導入 BL21（DE3）感受態細胞中，冰浴后加入900 μL不含卡那霉素的LB培養基，在37℃、160 r/min條件下培養約 1 h，8 000 r/min離心1 min后保留200 μL上清液，重懸后涂布于LB固體培養基上[14]。

1.5 菌液PCR驗證及突變株高通量篩選

將轉化成功的菌落保存在含有200 μL LB液體培養基的96孔板中，活化兩次后加入誘導劑IPTG（終濃度為1 mmol/L），30℃、130 r/min誘導8 h。誘導后3 500 r/min離心45 min，棄上清，收集菌體。加入100 μLPBS重懸，在-80℃、30 min和30℃、30 min條件下交替凍融3次～5次，將活力提高明顯的突變株在37℃、180 r/min條件下過夜培養。在克隆引物的作用下，以擴大培養后的菌液為模板進行PCR擴增[13]，進行0.1%瓊脂糖凝膠核酸電泳驗證，證明CpAK基因導入到菌體中，同時取1 mL菌液送至上海生工測序進行高通量篩選，進一步確定此菌體是否突變成功，并將篩選成功的突變株菌種保存用于后續試驗。

1.6 AK粗酶液及純化液制備

取2 mL活化后菌液轉接至100 mL LB培養基，37℃、200 r/min培養至OD600達0.6～0.8，加IPTG誘導發酵8 h。4℃、8 000 r/min離心10 min后棄上清液，加10 mL～15 mL預冷的PBS緩沖液重懸菌體，超聲破碎 14 min，4℃、8 000 rpm 離心 10 min，過 0.22 μm 濾膜即得AK粗酶液[14]。分別用20 mmol/L咪唑20 mL、40 mmol/L咪唑 15 mL、70 mmol/L咪唑 10 mL、100 mmol/L咪唑5 mL、200 mmol/L 3 mL咪唑進行洗滌以除去雜蛋白，再用500 mmol/L咪唑5 mL進行洗脫，同時用15 mLEP管進行接樣，所得即為AK純化液[15]。

1.7 SDS-PAGE和蛋白質免疫印跡（Western Blot，WB）驗證

將AK的粗酶液及純化液進行SDS-PAGE與Western blot驗證[16]。

1.8 酶動力學研究

本文研究采用5mL反應體系：底物L-天冬氨酸10 mmol/L、氨水 800 mmol/L、Tris-HCl緩沖液（pH8.0）100 mmol/L、β-巰基乙醇 10 mmol/L、ATP10.4 mmol/L、硫酸鎂1.6 mmol/L和氯化鉀800 mmol/L。對于酶動力學研究，需改變底物L-天冬氨酸濃度（分別為0.5、1、3、5、7、9、10、12、14、16 mmol/L），反應體系中其它條件不變，測定AK的活力。以Hill方程V=Vmax（Sn）/（Kn+Sn）進行線性擬合。

1.9 酶學性質研究

酶學性質的研究與酶動力學研究反應體系相同，均為5 mL反應體系。

1.9.1 最適pH值研究

反應體系其他條件不變，改變Tris-HCL的pH值（從6.0～10.0），測定AK的最適pH值。每個PH值檢測3個平行，將酶活最高組所對應的pH值定義為100%。

1.9.2 最適溫度研究

反應體系不變，在不同溫度下（15、20、25、26、28、30、35、40、45、50℃）測定 AK 的最適溫度[14]。每個溫度檢測3個平行，將酶活最高組所對應的溫度定義為100%。

1.9.3 穩定性研究

反應體系其他條件不變，在最適的pH值和溫度下測定AK的酶活（間隔1 h）。每1個小時檢測3個平行，對照組反應體系中不含有L-天冬氨酸，在0 h測量所得的相對酶活數值定義為100%。

1.9.4 底物抑制劑對AK活力的影響

在反應體系中添加不同濃度（0.2、1、5、10 mmol/L）的底物抑制劑，分別是：蘇氨酸（Threonine，Thr）、甲硫氨酸（Methionine，Met）、Lys、Thr+Met、Thr+Lys，Lys+Met和Thr+Lys+Met，測定抑制劑對AK活力的影響[14]。每組底物抑制劑檢測3個平行，共28組試驗，對照組的反應體系中不含有底物抑制劑，對照組相對酶活數值定義為100%。

1.9.5 金屬離子對AK活力的影響

在反應體系中添加不同濃度（0.2、1、5、10 mmol/L）的金屬離子，分別是：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+，測定金屬離子對 AK 活力的影響[14]。每組金屬離子檢測3個平行，共36組試驗，對照組的反應體系中不含有金屬離子，對照組相對酶活力數值定義為100%。

1.9.6 有機溶劑對AK活力的影響

在反應體系中添加不同濃度的（0.2、1、5、10mmol/L）有機溶劑，分別是：甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇、乙腈、二甲基亞砜、甘油，測定有機溶劑對AK活力的影響[14]。每組有機溶劑檢測3個平行，共28組試驗，對照組的反應體系中不含有有機溶劑，對照組相對酶活力數值定義為100%。

1.10 數據分析

進行3組平行試驗并用平均數加減標準差（mean±SD，x±s）表示。采用 SPSS19.0及 Origin8.5進行分析。

2 結果與分析

2.1 突變體T361D重組菌的構建

突變PCR及菌液PCR擴增結果見圖1。

圖1 PCR產物的1%瓊脂糖核酸電泳驗證Fig.1 1%agarose nucleic acid electrophoresis verification of PCR products

突變PCR結果如圖1A，分別在54、56、58℃3個退火溫度下進行PCR擴增。約7 000 bp處出現目標條帶，這與pET-28a-AK質粒長度6 822 bp（pET-28a 5 369 bp，CpAK 1 453 bp）相一致，結果表明了在退火溫度下，質粒復制成功，引物在重組質粒的作用下實現了大量擴增。

菌液PCR結果如圖1B，約1 000 bp～2 000 bp之間存在目標條帶，且與AK長度1 453 bp相對應，證明AK基因已導入BL21感受態細胞。測序（由上海生工進行）結果表示361位點氨基酸由T變為D，進一步驗證已成功構建突變體T361D。

2.2 SDS-PAGE和Western blot驗證

SDS-PAGE和Western blot驗證結果見圖2。

圖2 12%SDS-PAGE和Western blot驗證結果Fig.2 Results of 12%SDS-PAGE and Western blot

如圖2A所示，經純化后突變體在48KDa位置處出現條帶；Western blot驗證結果如圖2B所示，野生型和突變體T361D在48KDa位置處出現條帶，證明突變后AK表達成功。

2.3 T361D動力學結果

野生型（wild type，WT）和T361D動力學結果見圖3。

圖3 WT和T361D動力學結果Fig.3 Dynamics result of WT and T361D

如圖3所示，T361D AK的最大反應速率Vmax為25.34 U/mg·min，較 WT（Vmax 為 3.32 U/mg·min）提高了7.63倍；T361D AK的動力學參數Km值為4.60，與WT Km為4.13相比有所提高，說明T361D AK與底物的親和力下降；WT的希爾系數n值為4.57，T361D AK n值為1.26，突變后n值明顯低于野生型，證明正協同效應降低，突變后更趨于米氏酶，結合位點由致密結構變成松散結構，因此不利于與抑制劑相結合。

2.4 T361D酶學性質表征

2.4.1 最適溫度和最適pH值

最適溫度和最適pH值研究結果見圖4。

圖4 WT和T361D最適溫度（A）與PH值（B）Fig.4 The effect of optimum temperature(A)、pH(B)to WT and T361D

如圖4A所示，與WT相比T361D的最適溫度由26℃升高至30℃，在15℃～30℃區間內，酶活力逐漸升高并達到峰值，在30℃～50℃區間內，酶活力逐漸降低；如圖4B所示，與WT相比T361D最適pH值從7.5降低到7.0，當pH值小于7時，酶活力逐漸增高并達到峰值，而在大于7時，酶活力逐漸降低，當pH值達到10時，酶活力已不足10%。

這表明當溫度或pH值較低時，大部分酶的活性也較低，可以用于酶的保存；當溫度或pH值在最適區間時，酶的活性可逐漸達到最大，并對酶的催化反應有利；當溫度或pH值過高時，會使酶發生變性，逐漸失去活力。

2.4.2 穩定性

穩定性研究結果見圖5。

圖5 WT和T361D的熱穩定性Fig.5 The stability curves of WT and T361D

表1 金屬離子對WT與T361D酶活力的影響Table 1 The influence of metalions on the enzyme activity WT and T361D

如圖5所示，在最適的溫度（30℃）和pH（7.0）的情況下，測定WT和T361D酶活力和時間的關系[17-18]。野生型和突變體T361D的半衰期分別為3.9 h和4.9 h，突變后半衰期延長1 h，說明突變后AK的穩定性增強。

2.4.3 金屬離子對AK活力的影響

金屬離子對AK活力的影響見表1。

由表1可知，對于WT的影響，Mg2+和Mn2+對野生型有不同程度的激活作用，而 Na+、K+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+和Ni2+對野生型均表現出不同程度的抑制作用；對T361D AK的影響，一價金屬離子Na+和K+對酶產生明顯的激活作用；二價金屬離子，只有0.2 mmol/L的Mn2+表現出激活作用，其它金屬離子均有不同程度的抑制作用；三價金屬離子Fe3+產生抑制作用。

2.4.4 有機溶劑對AK活力的影響

有機溶劑對AK活力的影響見表2。

表2 有機溶劑對WT與T361D酶活力的影響Table 2 The influence of organic solvent on the enzyme activity WT and T361D

由表2可知，對于WT的影響，0.2 mmol/L與1 mmol/L的乙醇對野生型AK表現出激活作用，其他有機溶劑均有著不同程度的抑制作用；對T361D AK的影響，甲醇、異丙醇對AK的酶活力均有明顯提高，尤以濃度為10 mmol/L的甲醇和5 mmol/L、10 mmol/L的異丙醇對AK激活作用顯著，其他有機溶劑如正丁醇、乙腈對AK基本無激活，而乙醇、二甲基亞砜和甘油對AK酶活力均起到不同程度的抑制作用。

2.4.5 底物抑制劑對AK活力的影響

底物抑制劑對AK活力的影響見表3。

表3 底物抑制劑對WT與T361D酶活力的影響Table 3 The influence of substrate inhibitors on the enzyme activity of WT and T361D

由表3可知，對于 WT 的影響，在 Thr、Lys、Thr+Lys、Thr+Lys+Met存在條件下對野生型存在較強的抑制作用，在 Met、Thr+Met、Lys+Met存在條件下對野生型仍存在一定的抑制作用，但這些含有Met的組合均不同程度減弱了抑制作用；對T361D AK的影響，Met、Thr+Met存在條件下對T361D仍起到抑制作用，Thr+Lys+Met存在條件下仍存在抑制作用，但較野生型有明顯提高，Thr和Lys單獨存在時酶活力提高明顯，且表現出激活作用，Thr+Lys和Lys+Met的條件下活力提高明顯，且在高濃度條件下表現出激活作用。因此，說明在Lys或含有Lys的組合存在下對T361D的抑制作用部分解除，對AK酶活力產生激活作用，正與本研究的目的相符。

2.5 野生型及突變體T361D的空間結構比較

CgAK晶體結構見圖6。

圖6 CgAK晶體結構（PDB：3aaw）Fig.6 CgAK crystal structure（PDB：3aaw）

如圖6所示，CgAK晶體結構（3aaw，PDB）[11]中的 4個區域代表4個亞基，中間部分表示α亞基，兩側表示β亞基，α亞基和β亞基上都存在賴氨酸和蘇氨酸抑制劑結合位點[19]，當有賴氨酸或蘇氨酸結合時，導致AK的空間結構發生變化，不利于底物與AK結合，會使AK活力降低，對酶起抑制作用。T361D空間結構比較見圖7。

圖7 T361D空間結構比較Fig.7 T361D spatial structure comparison

由圖7可知，突變后氨基酸側鏈官能團發生了改變，使氨基酸所帶電荷和空間結構發生變化，由極性不帶電轉變為帶負電，且突變后AK與抑制劑Lys間發生離子鍵斷裂，R基遠離抑制劑Lys，因此抑制劑Lys穩定性降低，解除了抑制劑對AK酶活力的影響。

3 結論

對北京棒桿菌天冬氨酸激酶T361位點進行突變，從而解除與抑制劑Lys的離子鍵作用且將酶活提高。T361D與WT相比，酶動力學Vmax提高了7.63倍；最佳pH值降低至7.0，最佳反應溫度提升至30℃；半衰期由野生型的3.9 h延長到4.9 h；同時，突變體T361D對金屬離子Na+、K+和有機溶劑甲醇、異丙醇均表現出良好的抗性；底物抑制劑Lys以及含有Lys的組合對突變體T361D的抑制作用部分解除并表現出激活作用。綜上所述，本研究為解除AK的反饋抑制作用，從而獲得高產的天冬氨酸族氨基酸菌株提供了一定的理論依據。