殼寡糖通便功能的研究

梁宇軒，歐陽冬梅，王達(dá)，陳詠春，劉煥，賀永健，莊新棟，黃日明，孫遠(yuǎn)明，王弘

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省食品質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510642）

便秘（constipation）是一種由腸道癥狀定義的綜合征，表現(xiàn)為排便次數(shù)減少和（或）排便困難、糞便干硬、排便不盡感[1]。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國成人慢性便秘的患病率為4%～6%[2-4]，且患病率隨年齡增長而升高，60歲以上人群慢性便秘患病率高達(dá)22%[5]。便秘不但給患者帶來直接的痛苦，而且還可能誘發(fā)心腦血管疾病，增加大腸癌患病率[6-7]，導(dǎo)致抑郁或焦慮等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[8]，并給社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成巨大負(fù)擔(dān)[9]。

目前便秘常用的防治方法是藥物治療和飲食調(diào)節(jié)[10-15]。藥物治療常使用滲透性瀉劑[16-17]、刺激性瀉劑[18-19]、促分泌劑[20]和促動(dòng)力劑[21]等，效果多數(shù)雖較明顯，但有一定副作用。飲食調(diào)節(jié)近年來成為研究熱點(diǎn)，有較多關(guān)于補(bǔ)充低聚糖[11-12]、膳食纖維[13-14]和益生菌[15]對(duì)通便作用的研究報(bào)道，但不同種類的低聚糖、膳食纖維通便的作用均有差異。殼寡糖（chitooligosaccharide，COS）是 2-氨基-2 脫氧-β-D-葡萄糖通過 β-1，4糖苷鍵連接的呈堿性的水溶性低聚糖[22]，分子量范圍在322 Da～1 610 Da。2014年，衛(wèi)計(jì)委第六號(hào)公告正式批準(zhǔn)殼寡糖為新食品原料。關(guān)于COS通便作用鮮見研究報(bào)道。因此，以昆明小鼠為對(duì)象，開展本研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼寡糖：山東衛(wèi)康生物醫(yī)藥科技有限公司，含量84%，相對(duì)分子質(zhì)量為322 Da～1 610 Da；鹽酸洛哌丁胺：西安楊森制藥有限公司；阿拉伯樹膠：分析純，成都市科龍化工試劑廠；活性炭粉：分析純，天津市福晨化學(xué)試劑；101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器儀表有限公司；JJ1000型電子天平：常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；BS-110S天平：北京賽多利斯天平有限公司。

1.2 動(dòng)物

昆明種小白鼠SPF級(jí)（雄性，初始體重為18 g～22 g），由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（粵）2013-0002，小鼠飼養(yǎng)于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫（25±2）℃，相對(duì)濕度（55±5）%，自由獲取食物和飲水，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（粵）2014-0136，屏障環(huán)境由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003版）》中“通便功能檢驗(yàn)方法”[23]設(shè)計(jì)小腸運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)和排便實(shí)驗(yàn)，并在此基礎(chǔ)上測(cè)定糞便含水量。

1.3.1 劑量設(shè)計(jì)與分組

在小腸運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)中，50只小鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周

1.3.4 排便時(shí)間、糞便粒數(shù)和糞便重量測(cè)定

受試物灌胃方式同1.3.3。7 d后各組小鼠禁食不禁水16 h，模型對(duì)照組和3個(gè)劑量組分別給予鹽酸洛哌丁胺（10 mg/kg·BW），空白對(duì)照組給予蒸餾水，30 min后，COS 3個(gè)劑量組分別給予含相應(yīng)COS濃度的墨汁（含5%活性炭粉、10%阿拉伯樹膠），空白對(duì)照組和模型對(duì)照給墨汁灌胃后，每只小鼠均單籠飼養(yǎng)，正常飲食進(jìn)水。從給予墨汁開始計(jì)時(shí)，觀察記錄每只小鼠排出首粒黑便時(shí)間、6 h內(nèi)黑便粒數(shù)及重量。

1.3.5 糞便含水量的測(cè)定

收集1.3.4方法中6 h內(nèi)的新鮮糞便，立即稱量，隨后105℃烘干至恒重，稱量其干重。計(jì)算糞便含水量[24]。計(jì)算如式（2）：后，按體重隨機(jī)分組，每組10只。依據(jù)殼寡糖的人體推薦最大攝入量（0.5 g/d，人體體重以60 kg計(jì)），分別以人體最大推薦劑量的10、20、40倍設(shè)置小鼠的低、中、高劑量組，即劑量分別為99.2、198.4、396.8 mg/（kg·d）。空白對(duì)照組和模型對(duì)照組均給予蒸餾水。排便實(shí)驗(yàn)小鼠只數(shù)與分組方式同前。

1.3.2 試劑的配置

墨汁的配置：準(zhǔn)確稱取阿拉伯樹膠100 g，加水800 mL，煮沸至溶液透明，稱取活性碳粉50 g加至上述溶液中煮沸3次，待溶液涼后加水定容到1 000 mL，于冰箱中4℃保存，用前搖勻。

鹽酸洛哌丁胺懸濁液的配置：臨用前，根據(jù)小鼠體重和灌胃劑量（0.3 mL），配置鹽酸洛哌丁胺懸濁液。在小腸運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)中，鹽酸洛哌丁胺給予劑量為5 mg/kg·BW，在排便實(shí)驗(yàn)中，鹽酸洛哌丁胺給予劑量為 10 mg/kg·BW。

1.3.3 小腸運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)

每日定時(shí)經(jīng)口灌胃一次，灌胃體積為0.3 mL。劑量組給予不同濃度的COS，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組均給予等體積蒸餾水，連續(xù)灌胃7 d。7 d后各組小鼠禁食不禁水16 h，模型對(duì)照組和COS 3個(gè)劑量組給予鹽酸洛哌丁胺（5 mg/kg·BW），空白對(duì)照組給予蒸餾水。30 min后，COS 3個(gè)劑量組分別給予含相應(yīng)COS濃度的墨汁（含5%活性炭粉、10%阿拉伯樹膠），空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予墨汁灌胃。25 min后頸椎脫臼法處死小鼠，打開腹腔分離腸系膜，剪取上端自幽門、下端至盲腸部的整段小腸，不加牽引平鋪呈直線。測(cè)量小腸全長和幽門至墨汁運(yùn)動(dòng)前沿，計(jì)算小腸墨汁推進(jìn)率，如式（1）。

1.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定

采用SPSS Statistics 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。小腸墨汁推進(jìn)率需進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換公式如式（3）。需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊時(shí)，采用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）檢驗(yàn)；若方差不齊，則進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[23]。

式中：p為小腸墨汁推進(jìn)率，轉(zhuǎn)換值X用小數(shù)表示。

6 h內(nèi)黑便粒數(shù)或6 h內(nèi)黑便重量任一項(xiàng)結(jié)果陽性，同時(shí)小腸運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)和首粒排黑便時(shí)間任一項(xiàng)結(jié)果陽性，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼寡糖對(duì)小鼠體重的影響

進(jìn)行小腸運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)和排便實(shí)驗(yàn)時(shí)各組小鼠初始體重一致（見表1、表2）。給予相應(yīng)受試物7 d后，空白對(duì)照組、模型對(duì)照組及3個(gè)劑量組小鼠最終體重均無顯著性差異，表明COS對(duì)小鼠的正常生長發(fā)育無不良影響。

表1 小腸墨汁推進(jìn)實(shí)驗(yàn)中殼寡糖對(duì)小鼠體重的影響Table 1 The effect of COS on the weight of mice in intestinal movement experiment

表2 排便實(shí)驗(yàn)中COS對(duì)小鼠體重的影響Table 2 The effect of COS on the weight of mice in defecating experiment

2.2 殼寡糖對(duì)小鼠小腸運(yùn)動(dòng)的影響

殼寡糖對(duì)小鼠小腸運(yùn)動(dòng)的影響見表3。

表3 COS對(duì)小鼠小腸運(yùn)動(dòng)的影響Table 3 The effect of COS on intestinal movement of mice

在小腸運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)中，模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比，小腸墨汁推進(jìn)率顯著降低（p<0.01），表明給予鹽酸洛哌丁胺后，小鼠小腸蠕動(dòng)抑制模型建立成功。與模型對(duì)照組比，各劑量組小腸墨汁推進(jìn)率均有一定程度增加，其中，COS中劑量組小腸墨汁推進(jìn)率（51.96±9.95）%顯著增加（p<0.05），COS高劑量組小腸墨汁推進(jìn)率（60.48±13.60）%極顯著增加（p<0.01）。

表4 COS對(duì)小鼠排便的影響Table 4 The effect of COS on defecating of mice

2.3 殼寡糖對(duì)小鼠排便時(shí)間、糞便粒數(shù)和糞便重量的影響

殼寡糖對(duì)小鼠排便時(shí)間、糞便粒數(shù)和糞便重量的影響見表4。

在排便試驗(yàn)中，模型對(duì)照組小鼠首粒排黑便時(shí)間極顯著長于空白對(duì)照組（p<0.01），而6 h黑便粒數(shù)和重量均極顯著小于空白對(duì)照組（p<0.01），說明小鼠便秘模型成立。在首粒排黑便時(shí)間上，與模型對(duì)照組（342.4±33.6）min比，COS各劑量組小鼠的首粒排黑便時(shí)間均有一定程度的縮短，并呈劑量依賴關(guān)系，其中高劑量組（157.2±56.4）min首粒排黑便時(shí)間極顯著縮短（p＜0.01）；在小鼠6 h黑便粒數(shù)和黑便重量上，隨著COS劑量增加而增加，其中COS高劑量組6 h黑便粒數(shù)（7.8±3.7）粒相對(duì)模型對(duì)照組（1.9±2.0）粒顯著增加（p＜0.05）。在小鼠6 h黑便重量上，中劑量組小鼠（134±63）mg和高劑量組小鼠（145±80）mg相對(duì)模型對(duì)照組小鼠（33±43）mg均顯著增加（p＜0.05）。

表5 COS對(duì)小鼠糞便含水量的影響Table 5 Effect of COS on stool moisture content

表6 COS和其他低聚糖對(duì)小鼠通便的作用Table 6 The laxative effect of COS and the other oligosaccharides on mice

2.4 殼寡糖對(duì)小鼠糞便含水量的影響

殼寡糖對(duì)小鼠糞便含水量的影響見表5。

由表5可知，模型對(duì)照組和空白對(duì)照組與COS各劑量組小鼠的糞便含水量間無顯著差異，表明COS各劑量組并未增加小鼠糞便持水。

2.5 COS和其他低聚糖對(duì)小鼠通便的作用

COS和其他低聚糖對(duì)小鼠通便的作用見表6。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他低聚糖通便功能研究結(jié)果[25-28]相比，其有效劑量相對(duì)較低，表明COS具有通便潛在的優(yōu)勢(shì)（表6）。如小腸墨汁推進(jìn)率指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)COS中劑量組[198.4 mg/（kg·d）]呈現(xiàn)顯效（p<0.05），而低聚果糖[25]、低聚果糖[26]、皇帝蕉低聚糖[28]、粉蕉低聚糖[28]分別為9.90、2.50、1.25、1.25 g/（kg·d）時(shí)才達(dá)到顯效（p<0.05或p<0.01），有效劑量約相差6倍到49倍；首粒黑便時(shí)間（min）、6 h黑便粒數(shù)、6 h黑便重量（mg）等指標(biāo)也呈現(xiàn)類似趨勢(shì)。

3 討論

結(jié)果表明：與模型對(duì)照組比，COS中劑量組[198.4 mg/（kg·d）]顯著增加小鼠小腸墨汁推進(jìn)率和6 h黑便重量（p<0.05）；COS高劑量組[396.8 mg/（kg·d）]極顯著增加小鼠小腸墨汁推進(jìn)率（p<0.01）、極顯著縮短首粒排黑便時(shí)間（p<0.01）、顯著增加6 h黑便重量和6 h黑便粒數(shù)（p<0.05）。根據(jù)衛(wèi)生部“通便功能檢驗(yàn)方法”[23]判定標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)小腸運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)和排便時(shí)間任一項(xiàng)結(jié)果陽性，同時(shí)6 h黑便粒數(shù)和6 h黑便重量任一結(jié)果陽性，可判定COS對(duì)小鼠有通便作用。在COS中劑量下，小腸墨汁推進(jìn)率和6 h黑便質(zhì)量均顯著增加（p<0.05），可判定COS對(duì)小鼠有通便作用，COS高劑量組4項(xiàng)結(jié)果均為陽性，通便作用更佳。

關(guān)于低聚糖通便可能有兩條途徑，一是通過增加糞便含水量，軟化糞便、增大體積，從而改善便秘[29-32]；二是調(diào)節(jié)腸道菌群，促進(jìn)微生物發(fā)酵，從而加速腸道傳輸[32-36]；或者二者兼有。本實(shí)驗(yàn)中，各劑量組、模型對(duì)照組及空白對(duì)照組之間，糞便含水量無顯著性差異，表明COS不是通過第一條途徑起作用的，推測(cè)可能是通過第二條途徑起作用，即COS調(diào)節(jié)腸道菌群，促進(jìn)微生物發(fā)酵，酵解產(chǎn)物（特別是短鏈脂肪酸）產(chǎn)生滲透作用，從而加速腸道傳輸，通便。