仙參果酒體內外抗氧化活性的研究

鄭飛，韓銘鑫，賀陽，張琰，喬夢丹，文連奎，戴雨霖，越皓，*

（1.長春中醫藥大學吉林省人參科學研究院，吉林長春，130117；2.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春，130118）

仙參果酒是以人參及仙人掌果為原料，按其發酵工藝條件所釀制而成。其中，人參是五加科植物人參（Panaxginseng C.A.Mey.）的干燥根，人參皂苷是人參的主要有效成分，具有廣泛的藥理活性，如抗疲勞、抗糖尿病、抗抑郁等作用[1-3]。此外，有研究表明，人參皂苷能顯著提高超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活力，具有較強的抗氧化作用[4]。仙人掌果為仙人掌科植物仙人掌的果實，果肉微酸甜，含有豐富的微量元素、蛋白質、氨基酸、黃酮類等營養物質，具有行氣活血、提高免疫力、清除自由基等作用[5-7]。本研究前期工作中通過控制人參與仙人掌果加入量的比例來滿足發酵液體系的pH值，在酸性條件下及微生物發酵過程中可使人參中原人參二醇型皂苷Rb1、Rb2等和原人參三醇型Re、Rg1等主要皂苷轉化生成稀有人參皂苷，如人參皂苷 Rh1、Rg2、F2、Rg3、CK、Rh2 等，研究表明[8-9]，這些稀有人參皂苷具有更顯著的藥理活性。因此，本研究在前期發酵工藝完成的基礎上，對仙參果酒中人參皂苷和花青素進行含量測定，并對體內外抗氧化活性進行評價，為后續的功能食品和保健食品開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ICR 小鼠，50只，雄性，體重量 18 g～22 g，購自吉林大學白求恩醫學院實驗動物中心，許可證書編號為SCXK（吉）-2011-0004。

仙人掌果：海南富匯達農業開發有限公司；五年生人參：吉林省撫松縣萬良人參市場。

1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（1，l-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：西安熱默爾生物科技有限公司；AmberliteXAD-2大孔樹脂：Sigma公司；D-半乳糖：上海源葉生物有限公司；總抗氧化能力（total anti-oxidative capacity，T-AOC）測定試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）測定試劑盒、丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）測定試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

M200PRO型酶標儀：TECAN公司；Agilent 1200型快速分離液相色譜系統、Agilent 6520 Q-TOF質譜儀：美國Agilent公司；HH-8型數顯恒溫水浴鍋：常州智博瑞儀器制造有限公司；centrifuge 5804R型離心機：Eppendonf公司；T25 digital ULTRA-TURRAX數顯勻漿機：德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 仙參果酒的制備

以質量計，取鮮人參1份，清洗，切成2 mm～3 mm左右的薄片，加入3倍～5倍量水打漿，仙人掌果3份，去皮去刺后打漿，兩者混合；取鮮人參及仙人掌果混合漿液，加入白砂糖適量使含總糖量達到7%，按0.1%加入活化后的酵母，攪拌均勻，進行主發酵和后發酵；主發酵控制發酵溫度為18℃～20℃，主發酵1 d～12 d，酒精度達到4%vol～6%vol結束主發酵，過濾掉發酵液中的殘渣，后期發酵溫度10℃～12℃，時間30d～40d。發酵結束后，采用有機陶瓷膜過濾設備濾過，滅菌、裝瓶。

1.3.2 總皂苷的含量測定

精密量取仙參果酒50 mL，60℃水浴揮干，10 mL純化水溶解，吸取1.0 mL進行柱層析。在2 cm直徑層析柱內裝入3 cm高AmberliteXAD-2大孔樹脂，上加1 cm中性氧化鋁。先用25 mL 70%乙醇洗柱，棄去洗脫液，再用25 mL水洗柱，棄去洗脫液，精確加入1.0 mL已處理好的試樣溶液，用25 mL水洗柱，以洗去糖份等水溶性雜質，棄去洗脫液，用25 mL70%乙醇洗脫人參皂苷，收集洗脫液于蒸發皿中，水浴揮干，以此做顯色用。在上述已揮干的蒸發皿中準確加入0.2mL 5%香草醛冰醋酸溶液，轉動蒸發皿，使殘渣都溶解，再加0.8 mL高氯酸，混勻后移入5 mL具塞試管中，放在60℃以下水浴加熱10 min，取出，冷水冷卻后，準確加入冰醋酸5.0 mL，搖勻后，以1 cm比色皿于560 nm波長處與標準管一起進行比色測定。精密吸取人參皂苷 Re標準溶液（2.0 mg/mL）200 μL 置蒸發皿中，60℃水浴揮干，2.0 mL純化水溶解，吸取1.0 mL進行柱層析，方法同試樣，測定吸光度值。采用外標法求得供試品中總皂苷的含量。

1.3.3 總花青素的含量測定

精密稱取矢車菊-3-O-葡萄糖苷標準品約5 mg于 5 mL量瓶中，用0.1%鹽酸-80%乙醇（15∶85，體積比）溶解，稀釋，并定容，搖勻，即得（每1 mL溶液中含有1 mg矢車菊-3-O-葡萄糖苷的標準品溶液）。精密量取經發酵工藝制得的仙參果酒50 mL溶液，40℃水浴揮干，0.1%鹽酸-80%乙醇（15∶85，體積比）溶解于10 mL量瓶中，稀釋并定容，搖勻，過濾。以相應試劑作為空白試劑。于波長535 nm處測定吸光度值，采用外標法求得供試品中總花青素的含量。

1.3.4 體外抗氧化活性的測定

1.3.4.1 樣品溶液的制備

取經發酵工藝制得的仙參果酒適量，離心（4 000 r/min，5 min），精密量取上清液2.5 mL溶液，40℃水浴揮干，0.1%鹽酸-80%乙醇（15∶85，體積比）溶解于2 mL量瓶中，稀釋成不同濃度的樣品溶液，用于還原力、DPPH自由基清除力、羥基自由基（·OH）清除力、O2-·清除力的測定。

1.3.4.2 還原力的測定

參照文獻[10-11]的方法，在10 mL比色管中加入1.5 mL 0.2 mol/L的磷酸緩沖液（pH6.6）、不同濃度（0.5 mL/mL～2.5 mL/mL）的樣品溶液2 mL和質量分數為1%的鐵氰化鉀溶液2 mL，50℃水浴鍋加熱20 min，冷卻，加入2 mL質量分數為10%的三氯乙酸溶液混合后，以 3 000 r/min離心20 min，取上清液2 mL，加入2 mL純化水和0.5 mL質量分數為0.1%的三氯化鐵，混勻，放置10min，在700nm波長處測定吸光度（A700nm）。

1.3.4.3 DPPH自由基清除力的測定

參照文獻[12-13]的方法，將2 mL的DPPH溶液（0.04 mg/mL，95%乙醇）與不同濃度（0～1.0 mL/mL）的樣品溶液2 mL混勻后，在室溫下反應30 min，在517 nm波長處測定吸光度（A1），其中每個質量濃度做3個平行樣品，同時，將2 mL的DPPH溶液與樣品空白 2 mL混勻后測定吸光度（A0），將不同濃度的樣品溶液2 mL與95%乙醇2 mL混勻后測定吸光度（A2），按式（1）計算DPPH自由基清除率。

1.3.4.4 羥基自由基（·OH）清除力的測定

參考王強等[14-15]的方法，在10 mL試管中依次加入不同濃度（0～1.0 mL/mL）的樣品溶液2 mL、0.6 mL 8.0 mmol/L的FeSO4溶液、1 mL 6.0 mmol/L的 H2O2溶液和2 mL 3 mmol/L的水楊酸溶液，搖勻，室溫靜置30 min，于37℃條件下水浴1 h，于510 nm波長處測定樣品吸光度（A1），以純化水代替樣品測得空白對照吸光度（A0），以純化水代替水楊酸測定樣品吸光度（A2），其中每個樣品濃度做3個平行樣品，按照公式（2）計算·OH的清除率。

1.3.4.5 O2-·清除力的測定

參照文獻[16]的方法，在10 mL比色管中加入樣品溶液 0.1 mL和 0.1 mmol/L的 Tris-HCl緩沖液（pH8.2）2.8 mL混勻，在25℃水浴10 min后加入0.1 mL 3mmol/L的鄰苯三酚溶液（25℃水浴預熱），混勻后立即在325 nm波長處測定吸光度，每30秒讀取A325nm，3 min后結束；以純化水0.1 mL和0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH8.2）2.8 mL調零；空白對照管以純化水代替樣品溶液。作吸光度隨時間變化的回歸方程，其斜率為鄰苯三酚自氧化速率v，按照公式（3）計算O2-·的清除率。

1.3.5 體內抗氧化活性的測定

1.3.5.1 實驗動物條件和分組

實驗前取50只體質量在18 g～22 g的雄性ICR小鼠，在實驗環境下給予基礎飼料飼養7 d，隨機分為空白組、模型組、仙參果酒的低、中、高劑量組，每組10只。除空白組外，其余4組每天腹腔注射1.2 g/kg 98%D-半乳糖（采用生理鹽水配制），同時仙參果酒低、中、高劑量組按1、2、4 mL/（kg·d）的劑量灌胃仙參果酒，空白組灌胃給予等體積的生理鹽水，每隔2天～3天稱重，連續灌胃35 d[17-21]。

1.3.5.2 生化指標的測定

實驗小鼠末次給藥24小時后摘眼球取血，4 000 r/min離心10 min，取上清液血清測試各生化指標。將小鼠頸椎脫臼處死，同時摘取小鼠肝臟組織，并用生理鹽水洗凈后用濾紙吸干稱重。用高速勻漿機制備10%的肝組織勻漿，4 000 r/min離心10 min，取上清液備用。所有處理均在4℃條件下完成。

樣品的總抗氧化能力（T-AOC）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）均采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒進行測定。

1.3.5.3 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 仙參果酒中功能成分的含量測定結果

2.1.1 總皂苷的含量測定結果

采用外標法求得3批樣品中的人參總皂苷含量平均值為（93.76±0.19）mg/100 mL。

2.1.2 總花青素的含量測定

采用外標法求得3批樣品的總花青素含量平均值為（10.66± 0.13）mg/100 mL。

2.2 仙參果酒的體外抗氧化活性研究

抗氧化劑的還原能力與其抗氧化活性之間存在一定的關系，抗氧化劑通過自身的還原能力給出電子而清除自由基，還原能力越強，抗氧化活性就越強。因此，我們可以通過測定還原能力來說明抗氧化能力的強弱[22]。本研究通過抗氧化物質提供電子把鐵氰化鉀中Fe3+還原成Fe2+，而Fe2+在700 nm波長處有最大的吸光度，吸光度值越大說明樣品還原能力越強，抗氧化活性越高。仙參果酒的還原力見圖1。

圖1 仙參果酒的還原力Fig.1 Reducing power of cactus fruit ginseng wine

由圖1可知，在樣品濃度（0.5 mL/mL～2.5 mL/mL）范圍內，還原力（Y）與仙參果酒的樣品濃度（X，mL/mL）呈線性關系，回歸方程為Y=0.173X+0.014（R2=0.997）。

DPPH自由基是很穩定的N-中心自由基，與機體的許多功能障礙和疾病的發生密切相關，可以用來評價化合物或是醫藥原料清除自由基或給電子的能力[23]。羥基自由基是公認的最活潑最有害的自由基，會嚴重損傷相鄰的生物分子造成脂質過氧化[24]。因此，探討仙參果酒對DPPH自由基、·OH和O2-·的清除作用具有重要意義。仙參果酒清除DPPH自由基的能力見圖2。

如圖2，仙參果酒對DPPH自由基的清除率隨著仙參果酒樣品濃度的增加而逐漸增大，清除率在13.5%～69.9%，兩者呈正相關；當樣品濃度達到0.6 mL/mL及以上時，DPPH自由基清除效果變化不明顯。仙參果酒對·OH和O2-·的清除率的變化趨勢與其清除DPPH自由基相似，如圖3、圖4所示。

圖2 仙參果酒清除DPPH自由基的能力Fig.2 DPPH radical scavenging activity of cactus fruit ginseng wine

圖3 仙參果酒清除·OH的能力Fig.3 Hydroxy radical scavenging activity of cactus fruit ginseng wine

圖4 仙參果酒清除O2-·的能力Fig.4 Superoxide anion radical scavenging activity of cactus fruit ginseng wine

2.3 仙參果酒的體內抗氧化活性研究

D-半乳糖衰老模型被廣泛用于抗氧化活性的藥效學評價。CAT活力、MDA含量，SOD活力、T-AOC水平和GSH-Px活力是體內最重要的抗氧化指標，可清除體內的自由基[25]。仙參果酒對小鼠血清CAT、MDA、SOD、T-AOC和GSH-Px含量的影響見表1。

由表1可知，與空白組比較，模型組小鼠血清中CAT、MDA、SOD、T-AOC、GSH-Px酶活力都具有顯著性差異（P<0.05），其中 CAT、MDA、SOD、T-AOC 酶活力具有極顯著性差異（P<0.01），表明模型成立。與模型組比較，仙參果酒高、中、低3個給藥組中SOD、GSHPx酶活力均具有顯著性差異（P<0.05），CAT、MDA、TAOC酶活力均具有極顯著性差異（P<0.01）。

表1 仙參果酒對小鼠血清CAT、MDA、SOD、T-AOC和GSH-Px含量的影響（±s，n=10）Table 1 Effect of cactus fruit ginseng wine on CAT，MDA，SOD，T-AOC and GSH-Px in mouse serum（±s，n=10）

表1 仙參果酒對小鼠血清CAT、MDA、SOD、T-AOC和GSH-Px含量的影響（±s，n=10）Table 1 Effect of cactus fruit ginseng wine on CAT，MDA，SOD，T-AOC and GSH-Px in mouse serum（±s，n=10）

注：與空白組比較，*為p<0.05差異顯著，**為p<0.01差異極顯著；與模型組比較，#為p<0.05差異顯著，##為p<0.01差異極顯著。

組別CAT/（U/mL）MDA/（nmol/mL）SOD/（U/mL）T-AOC/（U/mL）GSH-Px/（U/mL）空白組 8.599 7±0.827 0 1.764 7±0.500 5 22.359 1±0.573 3 15.496 8±2.643 4 340.350 6±37.111 8模型組 2.119 7±0.274 2** 4.470 6±0.393 8** 20.047 1±1.470 6** 7.441 0±1.167 3** 275.638 2±62.784 7*高劑量組 9.530 2±1.260 0## 2.257 7±0.365 5## 21.565 9±0.689 2# 19.408 2±2.252 6## 329.495 1±12.354 8#中劑量組 9.726 3±1.023 2## 2.164 2±0.530 3## 21.405 4±1.020 9# 14.684 4±1.303 0## 316.262 3±12.396 0#低劑量組 8.626 8±1.493 3## 1.378 2±0.693 3## 21.497 4±0.528 4# 11.625 7±1.359 7## 305.490 9±13.641 4#

表2 仙參果酒對小鼠肝臟CAT、MDA、SOD、T-AOC和GSH-Px含量的影響（±s，n=10）Table 2 Effect of cactus fruit ginseng wine on CAT，MDA，SOD，T-AOC and GSH-Px in mouse liver（±s，n=10）

表2 仙參果酒對小鼠肝臟CAT、MDA、SOD、T-AOC和GSH-Px含量的影響（±s，n=10）Table 2 Effect of cactus fruit ginseng wine on CAT，MDA，SOD，T-AOC and GSH-Px in mouse liver（±s，n=10）

注：與空白組比較，**為p<0.01差異極顯著；與模型組比較，##為p<0.01差異極顯著。

組別CAT/（U/mg prot）MDA/（nmol/mg prot）SOD/（U/mg prot）T-AOC/（U/mg prot）GSH-Px/（U/mg prot）空白組 18.030 6±1.377 2 0.464 3±0.080 4 14.073 6±0.575 5 0.249 3±0.058 7 607.920 8±21.821 3模型組 9.465 9±1.322 3** 1.973 6±0.536 7** 11.803 9±0.778 1** 0.154 8±0.033 5** 499.445 8±25.296 6**高劑量組 19.899 1±1.195 2## 1.280 1±0.168 7## 27.691 8±2.365 4## 0.331 2±0.100 6## 705.575 6±29.548 4##中劑量組 16.057 3±1.001 6## 0.499 2±0.165 3## 22.579 3±2.816 3## 0.387 6±0.095 4## 659.162 2±20.634 7##低劑量組 15.560 6±0.679 9## 0.586 2±0.201 2## 15.840 7±2.413 0## 0.284 9±0.091 8## 618.922 0±20.877 1##

仙參果酒對小鼠肝臟CAT、MDA、SOD、T-AOC和GSH-Px含量的影響見表2。

由表2可知，與空白組比較，模型組小鼠肝臟中CAT、MDA、SOD、T-AOC、GSH-Px酶活力都具有極顯著性差異，表明模型成立。與模型組比較，人參仙人掌果保健酒高、中、低3個給藥組和陽性組CAT、MDA、SOD、T-AOC、GSH-Px酶活力均具有極顯著性差異（P<0.01）。結果表明，仙參果酒高、中、低3個劑量可以提高肝臟中抗氧化酶的活力，清除肝臟中的過氧化物，仙參果酒具有較強的抗氧化能力。

3 結論

仙參果酒是人參和仙人掌果為原料，經發酵工藝制得的保健酒，不僅降低了人參的燥性，同時轉化生成稀有人參皂苷，提高了其抗氧化、增強免疫力等活性，其中主要活性成分為人參皂苷[（93.76±0.19）mg/100 mL]和花青素[（10.66±0.13）mg/100 mL]。在后期的進一步研究中采用高效液相色譜-質譜聯用技術對仙參果酒中人參皂苷類成分進行檢測，結果表明檢測到27種人參皂苷，與發酵前比較，含量明顯減少有人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc，含量相對增加有人參皂苷為 Rb2 和Rd，同時生成了稀有人參皂苷，主要有Rh1、Rg2、Rg4/Rg6、F2、Rk3/Rh4、Rg3、Rh2、CK、Rk1/Rg5。有研究報道發現[26-28]，糖苷類化合物由于極性強、分子量大，口服吸收生物利用度相對較低，難以直接發揮藥效作用，而是在腸道中被腸道菌群代謝生成次級代謝產物或苷元，它們可能是人參在體內發揮藥效作用的活性物質。

仙參果酒的體外抗氧化實驗結果表明，具有較高的還原力和自由基清除能力，其抗氧化能力與其質量濃度有較好的量效關系，總抗氧化能力較強。同時本實驗通過皮下注射D-半乳糖構建衰老小鼠模型，研究仙參果酒的體內抗氧化活性，不同劑量的給藥組可以顯著提高D-半乳糖衰老模型小鼠血清和肝臟組織中的 CAT 活力、SOD、GSH-Px活力和 T-AOC（P<0.05），降低血清及肝臟組織MDA含量（P<0.05）。仙參果酒可以提高機體總抗氧化能力，提高抗氧化酶活性和還原性保護物質谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量，清除機體中的有毒有害物質和自由基，從而減輕機體的損傷程度從而起到抗脂質過氧化的作用。同時又通過減少機體中的有害物質MDA含量，降低脂質過氧化作用形成脂質過氧化物含量，減緩機體膜系統受氧自由基攻擊后的損傷，從而間接增強機體抵抗自由基攻擊的能力[27-29]。說明仙參果酒對小鼠體內抗氧化/氧化平衡狀態有明顯的穩定作用。本研究為仙參果酒在功能食品和保健食品領域的開發奠定基礎。