霍山石斛姜黃葛根膠囊安全性研究

李 志，王升貴，唐 川

(九仙尊霍山石斛股份有限公司，上海閔行 201199)

霍山石斛姜黃葛根膠囊是以霍山石斛提取物、姜黃素、葛根提取物為原料，以淀粉、硬脂酸鎂為輔料，經制粒、干燥、混合、填充等工藝加工制備而成的具有增強免疫力、對化學性肝損傷有輔助保護作用的保健食品。霍山石斛又稱霍斛、米斛、霍石斛等，是皖西地區重要的名貴藥材，屬國家一級保護植物，《百草鏡》記載：“石斛，出自六安州及潁州府霍山縣，稱霍山石斛，最佳”[1]。對于霍山石斛安全性，李濱等[2]對霍山石斛毒理學的研究結果表明，霍山石斛無急性毒性、亞急性毒性與致突變作用，霍山石斛最大觀察到的有害作用劑量(NOAEL)為20.0 g/kg。李然等[3]對姜黃素進行毒理學試驗表明，姜黃素大/小鼠經口急性毒性試驗屬實際無毒物質，未見潛在的致突變、致微核及致畸形作用。沃興德等[4]對通過80 d長期毒性試驗結果表明,在試驗劑量內姜黃素對肝腎功能無影響、對10項血液生化指標、8項血液學指標無顯著影響。詹鍵等[5]對葛根進行評價，結果表明小鼠經口LD50在20 g/kg，屬于無毒級，未有致突變、致微核及致畸形作用。該品配方3種主要原料的原藥材“霍山石斛、姜黃、葛根”無“十九畏”和“十八反”等配伍禁忌。為了驗證霍山石斛姜黃葛根膠囊的安全性，筆者依據《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版)[6]毒理學檢驗方法進行安全性評價研究。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品。霍山石斛姜黃葛根膠囊，硬膠囊劑，由九仙尊牌霍山石斛股份有限公司生產。保質期24個月，成人推薦量為1.0 g/(人·d)(體重按60 kg計)。

1.1.2實驗動物。健康成年清潔級ICR小鼠由揚州大學比較醫學中心提供，生產許可證號SCXK(蘇) 2012-0004；SPF健康級離乳SD大鼠由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，生產許可證號：SCXK (滬)2013-0016。

實驗動物飼養環境：溫度20～25 ℃，相對濕度：40%～70%。實驗動物使用許可證號：SYXK(蘇)2012-0041。輻照鼠用滅菌飼料由江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司提供，合格證：蘇飼審(2008)01008。

1.1.3試驗菌株。鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102以及S-9均來源于復旦大學公共衛生學院。

1.1.4儀器。DT-1000電子天平、7100型全自動生化分析儀，SIEMENS ADVIA 2120i血液分析儀，OLYMPUS顯微鏡，BAKER SG-603生物安全柜，電熱恒溫培養箱，SX-700高壓滅菌器，KYC-100型恒溫搖床。

1.2方法

1.2.1急性毒理試驗。采用最大耐受量法，受試樣品給予劑量為15 000 mg/kg。受試樣品用無菌水配制，最大濃度為0.75 g/mL，按最大灌胃量(20 mL/kg)，一次灌胃給樣。給樣后連續觀察14 d，記錄中毒表現及死亡情況。

1.2.2Ames試驗。選鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102，經鑒定合格后進行試驗。試驗設5 000、1 000、200、40和8 μg/皿5個劑量組，每個劑量組做3個平皿。陽性物：不加S-9者為2,4,7-三硝基芴銅(TA97、TA98)，甲基磺酸甲酯(TA100、TA102)；加S-9者為2-氨基芴(TA97、TA98、TA100)，1,8-二羥基蒽醌(TA102)，設陰性對照組(未處理對照組和溶劑對照組)。采用標準平板摻入法進行培養，計數每皿回變菌落數。

1.2.3小鼠骨髓細胞微核試驗。采用30 h受試物法。ICR種清潔級小鼠50只，按體重隨機分為5組，每組10只，雌雄各半。受試樣品人可能攝入量的100倍為1 667 mg/kg，最高劑量設為10 000 mg/kg，設2 500、5 000、10 000 mg/kg 3個劑量組、陰性對照(無菌水，20 mL/kg灌胃)、陽性對照組(環磷酰胺，40 mg/kg腹腔注射)。取胸骨常規制片、鏡檢，觀察含微核的骨髓嗜多染紅細胞(PCE)數并計算微核發生率，結果采用Pisson分布U檢驗進行統計。并計算骨髓嗜多染紅細胞與成熟紅細胞(NCE)比值(PCE /NCE)。

1.2.4小鼠精子畸形試驗。選用ICR種清潔級性成熟雄性小鼠25只，按體重隨機分為5組，每組5只。受試樣品人的可能攝入量的100倍為：1 667 mg/kg，最高劑量設為10 000 mg/kg，設2 500、5 000、10 000 mg/kg 3個劑量組、陰性對照組(無菌水，20 mL/kg灌胃)，每天1次，連續5 d。于首次給樣后的第35天處死動物，取兩側附睪精子濾液按常規制片、鏡檢。每鼠計1 000個結構完整的精子，計算精子畸形發生率，結果采用秩和檢驗進行統計處理。

1.2.530 d喂養試驗。按人體推薦量的30、65和100倍設計，受試樣品摻入飼料中，攝食量按大鼠體重的10%折算，喂養30 d后，根據動物平均體重和平均攝食量，計算實際劑量雌性為0.56、1.23、1.88 g/(kg·d)(低、中、高)，相當于人體推薦量的34、74、113倍，雄性為0.59、1.27、1.95 g/(kg·d)(低、中、高)，相當于人體推薦量的35、76、117倍。對照組為基礎飼料。動物自由進食飲水。

每天觀察并記錄動物的一般表現、行為、中毒表現和死亡情況。每周稱1次體重和2次食物攝入量，計算每周及總的食物利用率。各組動物給予各劑量組飼料連續喂養30 d后，隔夜禁食，逐只稱重后，進行血液學指標和血液生化指標、臟器指數、病理學檢查。

用SPSS軟件對各試驗原始數據進行方差齊性檢驗，滿足方差齊要求的數據用單因素方差分析方法中多個試驗組與一個對照組間均數的兩兩比較方法進行統計處理，對方差不齊的數據資料采用秩和檢驗進行處理。

2 結果與分析

2.1急性經口毒性試驗試驗觀察期間，各組動物飲食和活動正常，生長良好，未見任何中毒表現及死亡。霍山石斛姜黃葛根膠囊對小鼠體重和死亡數的影響見表1。由表1可見，霍山石斛姜黃葛根膠囊雌雄小鼠急性經口最大耐受劑量(MTD)大于15 000 mg/kg，屬于無毒級。

表1 霍山石斛姜黃葛根膠囊對小鼠經口毒性的影響

2.2Ames試驗由表2可見，各劑量組回變菌落數均未超過陰性對照組回變菌落數的2倍，亦無劑量-反應關系。即霍山石斛姜黃葛根膠囊對鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102 4株試驗菌株，在加與不加S-9時，均未見有致基因突變作用。

表2 霍山石斛姜黃葛根膠囊Ames試驗回變菌落數

注：**表示超過陰性對照組菌落數2倍以上

Note: * * indicates more than 2 times the colony count in the negative control group

2.3小鼠骨髓細胞微核試驗由表3可見，各劑量組微核率與陰性對照組相比無顯著性差異(P>0.05)，而陽性對照組則顯著高于陰性對照組(P<0.01)。未見霍山石斛姜黃葛根膠囊對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核形成及嗜多染紅細胞與成熟紅細胞比值(PCE/NCE)產生影響。

表3 霍山石斛姜黃葛根膠囊對小鼠骨髓細胞微核發生率和PCE/NCE的影響(n=5)

注：**表示與0 mg/kg組比較，P<0.01

Note:* * indicates that there is a significant difference between the positive control group and the negative control group (P<0.01)

2.4小鼠精子畸形試驗由表4、5可見，各劑量組精子畸形率與陰性對照組比較，無顯著性差異(P>0.05)，而陽性對照組小鼠精子畸形率與陰性對照組比較有顯著提高(P<0.01)。因此霍山石斛姜黃葛根膠囊對小鼠精子畸形率未產生影響。

2.530d喂養試驗

2.5.1霍山石斛姜黃葛根膠囊對大鼠一般表現、體重、食物利用率的影響。在大鼠30 d喂養期間，各組動物一般表現和行為均未見明顯異常、無中毒表現、無死亡。由表6可見，雌雄大鼠各劑量的體重與 0 g/(kg·d)組比較，差異無統計意義(P>0.05)；經口給樣30 d后，各劑量組動物每周增重、進食量、食物利用率與0 g/(kg·d)組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

表4霍山石斛姜黃葛根膠囊對小鼠精子畸形率的影響(n=5)

Table4EffectofDendrobiumhuoshanensecurcuminpuerarincapsuleonspermdeformityrateinmice(n=5)

劑量Dosage mg/kg受檢精子數The number of tested sperm總畸形數Total deformity number畸形率Malformation rate∥%05 0001062.1±0.42 5005 0001082.2±0.45 0005 000951.9±0.310 0005 0001032.1±0.340 mg/kg (環磷酰胺)40 mg/kg cyclophosphamide5 0004118.2±0.9**

注：**表示與0 mg/kg組比較，P<0.01

Note:* *indicates that there is a significant difference between the positive control group and the negative control group (P<0.01)

表5 霍山石斛姜黃葛根膠囊對小鼠精子畸形類型及比例的影響

2.5.2霍山石斛姜黃葛根膠囊對大鼠血液學指標的影響。各組大鼠喂養30 d后，進行血液學指標測定。由表7可見，雌雄各項指標與0 g/(kg·d)組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.5.3霍山石斛姜黃葛根膠囊對大鼠血液生化指標的影響。由表8可見，1.23 g/(kg·d) 組雌性大鼠血清谷丙轉氨酶水平與0 g/(kg·d)組比較雖有統計學差異，但數值均在正常范圍內，且無劑量-反應關系，不認為具有不良生物學意義；其他劑量組的各項指標與0 g/(kg·d)組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

表6 霍山石斛姜黃葛根膠囊對大鼠體重增加、進食量、食物利用率的影響

表7 霍山石斛姜黃葛根膠囊對大鼠血液學指標的影響

表8 霍山石斛姜黃葛根膠囊對大鼠血生化的影響

接下表

2.5.4大體病理及病理學檢查

2.5.4.1霍山石斛姜黃葛根膠囊對大鼠臟器重量的影響。經口給樣30 d后，測量各組大鼠重要器臟的絕對重量及相對重量(器臟重/體重)。由表9可見，各劑量組各項指標與0 g/(kg·d)組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

表9 霍山石斛姜黃葛根膠囊對大鼠臟器重量的影響

2.5.4.2病理學檢查。各劑量組雌雄大鼠大體解剖觀察均未見異常改變。

對0 g/(kg·d)組雌性大鼠10例，0 g/(kg·d)組雄性大鼠10例，1.88 g/(kg·d)組雌性大鼠共10例，1.95 g/(kg·d)組雄性大鼠10例進行鏡檢，結果如下：① 肝臟。肝小葉結構清晰，肝索排列整齊；肝細胞大小基本一致，細胞核大小均一，核膜、核仁清楚，細胞質染色均勻。0 g/(kg·d)雌性組肝細胞輕度脂肪變性3例；0 g/(kg·d)雄性組肝細胞輕度脂肪變性1例，門管區輕度炎細胞浸潤3例；1.88 g/(kg·d)雌性組肝細胞輕度脂肪變性2例，門管區輕度炎細胞浸潤2例；1.95 g/(kg·d)雄性組肝細胞輕度脂肪變性1例，肝灶性輕度血腫1例。②腎臟。腎皮、髓質接線清楚，腎單位結構正常，腎小球無炎性改變、纖維化、玻璃樣病變等變化，腎小管亦未明顯病變。③脾臟。紅、白髓清楚，中央動脈位居脾小體中央，小體無明顯萎縮，脾竇擴張，脾小梁正常。④胃、十二指腸。表面黏膜正常，無炎性改變和糜爛、潰瘍形成。黏膜下、肌層、漿膜層均無炎性改變。⑤卵巢(雌性組)。卵巢內可見不同發育階段的卵泡及排卵后形成的黃體或白體。⑥睪丸(雄性組)。睪丸曲細精管由支持細胞及上皮細胞、初級、次級精母細胞構成，精細胞發育正常。

綜上，霍山石斛姜黃葛根膠囊不同劑量給予大鼠30 d后，受試動物一般情況良好；血液學指標及生化指標均在正常范圍；各器臟病理學組織學檢查均未見與受試樣品有關的病理改變。根據衛生部《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003版)之30 d喂養試驗，給予動物人體推薦劑量100倍

(實際劑量雌性為113倍,雄性為117倍)的九仙尊霍山石斛姜黃素葛根膠囊，未觀察到有害作用。

3 結論

急性毒性試驗結果表明，霍山石斛姜黃葛根膠囊小鼠急性經口MTD大于15 000 mg/kg，屬于無毒級；Ames試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗均為陰性，表明霍山石斛姜黃葛根膠囊無致基因突變作用，無致染色體畸變及生殖細胞遺傳毒性；30 d喂養試驗結果表明，霍山石斛姜黃葛根膠囊對動物的生長發育、造血功能、肝腎功能均無損害作用。綜上，霍山石斛姜黃葛根膠囊安全，無明顯的毒副作用，無致畸致突變作用。

霍山石斛產業近幾年得到了較大的發展，已成長為霍山的支柱型產業。國務院在《中藥材保護和發展規劃(2015—2020年)》[7]中提出“突破瀕危稀缺中藥材繁育技術，發展中藥材現代化生產技術，加強中藥材綜合開發利用”，而縱觀霍山石斛市場，仍以初加工產品為主，其綜合利用方面略顯不足。該研究可為霍山石斛產品的深度開發提供參考依據。