miR-34a靶向調控c-MET促進胰腺癌發展的分子機制及臨床意義

倪晨明 邵卓 倪燦榮 熊杰 王歡 胡昊 金鋼

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度約為21～25個核糖核苷酸的非編碼內源性小單鏈RNAs分子，通過與靶基因3′末端非編碼區互補結合調控其在細胞內的表達水平，廣泛參與多種細胞生理和病理過程，如細胞周期、凋亡、分化等[1-2]。miR-34a是經典的抑癌微小RNA[3-5]。為此，本研究檢測胰腺癌BxPC3細胞、胰腺癌組織及匹配的癌旁正常組織miR-34a表達，明確miR-34a調控的靶基因，分析miR-34a及其靶基因的表達與胰腺癌臨床病理參數的關系以及對BxPC3細胞增殖和轉移能力的影響。

資料與方法

一、組織標本及胰腺癌細胞株培養

選取2013年3月至2016年6月間上海長海醫院肝膽胰外科行手術切除的148例經病理證實的胰腺癌組織標本，其中男性75例，女性73例，年齡40～85歲，中位年齡61歲。高中分化102例，低分化46例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期138例，Ⅲ～Ⅳ期10例。取同期配對的癌旁經病理證實無癌細胞的正常胰腺組織20例。所有入組患者術前均未接受任何針對腫瘤的治療。

人胰腺癌細胞株BxPC3購自中科院上海細胞所，常規培養、傳代。取對數生長期細胞，分為對照組、miR-34a過表達組(miR-34a組)和c-MET基因沉默組(c-METsi組)。

二、方法

1．miR-34a結合位點的確定：利用Targetscan在線軟件預測發現c-MET的3′非編碼區(3′-UTR)存在miR-34a結合位點。采用Promega公司的pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression系統構建c-MET-3′UTR雙熒光素酶(luciferase)報告載體，按說明書分別克隆c-MET的野生型3′UTR及突變型3′UTR。采用脂質體法轉染BxPC3細胞，獲取firefly熒光素值與Renila熒光素信號值，以兩者比值表示熒光素酶活性，以對照組的活性為100%計算。

2．miR-34a組及c-MET si組BxPC3細胞株建立：miR-34a mimic及c-MET siRNA均購自上海吉瑪制藥技術公司，采用脂質體方法將它們分別轉染BxPC3細胞。Lipofectamine 3000購自Invitrogen Life Technologies公司，按說明書操作。

3．miR-34a及c-MET mRNA表達檢測：應用miRNeasy Mini Kit(Qiagen公司，Cat.217004)抽提各組細胞總RNA；應用miRNeasy FFPE Kit(Giagen公司，Cat. 217504)抽提石蠟組織標本總RNA。miR-34a檢測先用TaqManTMMicroRNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems Life Technologies公司，Cat. 4366596)反轉錄，再用TaqManTMUniversal Master Mix II, with UNG(Cat. 4440038)及miR-34a Taqman探針(Assay ID：000425)行莖環特異性熒光定量PCR反應。c-MET mRNA檢測先用PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa公司，Cat. RR037A)反轉錄，再用 SYBR?Advantage?qPCR Premix(TaKaRa公司，Cat. 639676)行熒光定量PCR反應。c-MET上游引物序列5′ -GTAAGTGCCCGAAGTGTA-3′，下游引物序列5′-TTTCTTGCCATCATTGTC-3′；內參GAPDH上游引物序列5′- TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′，下游引物序列5′-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3′。 以上所有操作均按試劑盒說明書進行。采用公式2-△△Ct計算mRNA表達量。

4．c-MET蛋白表達檢測： 收集各組對數生長期細胞，用裂解液抽提細胞總蛋白，應用BCA法定量后常規行蛋白質印跡法檢測c-MET蛋白表達，以GAPDH為內參。抗c-MET、GAPDH抗體均購自CST公司，最后ECL發光，X片曝光、顯影、定影。用Image J軟件分析，以目的條帶與內參條帶的灰度值比表示蛋白表達量。

取胰腺癌及匹配的癌旁組織切片，采用免疫組織化學法檢測c-MET蛋白表達，以PBS代替一抗作為陰性對照。兔抗人c-MET多克隆抗體購自Abcam公司(Cad:ab74217，1∶50稀釋)， 兔抗鼠HRP多聚物二抗購自丹麥DAKO公司，DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物技術有限公司。由2位病理科醫師采用雙盲法閱片。高倍鏡下(×400)隨機觀察5個視野，胞質或胞膜出現黃色或棕黃色顆粒為c-MET陽性，根據陽性細胞所占比例(10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分)及染色強度(無染色為0分，黃色為1分，深黃色為2分，褐黃色為3分)進行評分，兩分值相乘，0～4分定為c-MET陰性，5～12分定為c-MET陽性。

5．細胞增殖實驗：取各組對數生長期細胞，以每孔1×105細胞接種96孔板，分別培養1、2、3、4 d，每時間點設5個復孔。培養到時間后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續培養4 h，上酶標儀測定各孔在450 nm處的吸光度值。實驗重復3次，取均值。

6．細胞遷移實驗：應用Transwell小室檢測細胞遷移能力。取各組對數生長期細胞，用無血清培養液洗滌2次，上室內加入1×105個/ml的細胞懸液500 μl，下室加600μl含15% FBS的DMEM完全培養液，常規培養24 h，棄去上室內液體，用棉棒擦拭去上室底部隔膜表面覆蓋的細胞，隔膜用50%甲醇液固定15 min，PBS洗3遍，用結晶紫染色30 min，風干，鏡下隨機取6個視野計穿膜細胞數，取均值。

三、統計學處理

結 果

一、miR-34a直接作用靶點的證實

對照組、miR-34a組c-MET野生型3′UTR細胞的熒光素酶活性分別為100%、(65.00±4.04)%，對照組、miR-34a組c-MET突變型的熒光素酶活性分別為100%、(106.70±7.27)%，miR-34a組c-MET野生型的3′UTR較對照組顯著下調(t=8.66，P=0.001)，而c-MET突變型3′UTR與對照組比較差異無統計學意義(t=0.92，P=0.4107)，證實c-MET是miR-34a的靶基因。

二、各組細胞及胰腺癌和癌旁組織miR-34a、c-MET表達

20對匹配的胰腺癌和癌旁正常胰腺組織miR-34a表達水平分別為0.026±0.003、0.050±0.005，癌組織顯著低于癌旁正常組織，平均下調1.92倍，差異有統計學意義(t=4.03，P=0.003)。

對照組、miR-34a組BxPC3細胞c-METmRNA表達水平分別為0.085±0.009、0.045±0.003；c-MET蛋白表達量為1.133±0.120、0.400±0.058(圖1)，miR-34a組較對照組顯著下調，差異均有統計學意義(t=4.46,P=0.011；t=5.500，P=0.005)。

圖1 對照組(1)、miR-34a組(2)BxPC3細胞 c-MET蛋白表達

三、胰腺癌組織miR-34a、c-MET蛋白表達與臨床病理參數的關系

以所有胰腺癌標本miR-34a表達的中位數為界分為高表達組和低表達組，根據c-MET表達情況分為陽性組和陰性組。圖2顯示了胰腺癌與癌旁正常胰腺組織c-MET的蛋白表達。miR-34a高表達、c-MET陽性表達與胰腺癌TNM分期、腫瘤分化程度高度相關，而與其他臨床病理參數無顯著相關性(表1)。

圖2 胰腺癌(2A)及癌旁正常胰腺組織(2B)c-MET蛋白表達(免疫組化 ×200)

表1 miR-34a、c-MET表達與胰腺癌臨床病理參數的關系

四、miR-34a、c-MET表達對胰腺癌細胞增殖及轉移的影響

對照組、miR-34a組和c-METsi組BxPC3細胞生長曲線見圖3，培養第4天，miR-34a組和c-METsi組較對照組的細胞增殖活力顯著下降(t=4.446，P=0.0012；t=7.869，P=0.0001)；穿膜細胞數顯著減少(231±12比351±16，t=5.981，P=0.0039；259±7比351±16，t=5.181，P=0.0066；圖4)，差異均有統計學意義。

討 論

miR-34a在多種腫瘤的發生和發展中起到了重要作用，但其與胰腺癌關系報道較少。本研究發現相比癌旁正常組織，miR-34a在胰腺癌組織明顯下調；此外，本研究也發現低水平miR-34a與腫瘤分期及細胞分化程度成正相關，提示miR-34a可能在胰腺癌細胞增殖、侵襲等生物學過程中起到關鍵調節作用。高增殖活性是腫瘤重要的惡性生物行為之一[6-7]。研究發現miR-34a可調控如胃癌[8]、卵巢癌[9]、子宮內膜癌[10]及膠質瘤[11]等腫瘤細胞增殖。本研究發現在胰腺癌BxPC3細胞中過表達miR-34a后，細胞增殖活性顯著減弱。轉移是腫瘤生物學行為的另一個重要特征。本研究同樣發現胰腺癌BxPC3細胞中過表達miR-34a后，腫瘤細胞轉移能力顯著降低，提示miR-34a對胰腺癌具有重要的抑制作用。

圖3 對照組、miR-34a組和c-METsi組BxPC3細胞的生長曲線

圖4 對照組(4A)、miR-34a組(4B)和c-METsi組(4C)的穿膜細胞比較

利用在線預測軟件發現c-MET的3′UTR存在miR-34a結合位點。c-MET是胰腺癌重要的預后因子，高水平的c-MET往往提示患者預后不良[12-13]。研究發現，c-MET與其配體肝細胞生長因子受體結合引起酪氨酸的自身磷酸化，激活多條信號通路，調控腫瘤細胞的增殖、轉移和侵襲；此外c-MET還和血管內皮生長因子受體一起協同參與新生血管的形成[14]。本研究發現，c-MET在胰腺癌組織中陽性率達33.7%(50/148)，并且與胰腺癌臨床分期及細胞分化程度成正相關；抑制c-MET表達后，細胞增殖及轉移能力明顯下降，表明c-MET對胰腺癌有顯著的促進作用。進一步研究發現，過表達miR-34a可下調c-MET的轉錄及蛋白表達水平；雙熒光素酶報告載體系統也提示miR-34a可與c-MET的3′UTR直接作用而發揮抑制作用；組織檢測也發現miR-34a與c-MET表達呈負相關，提示胰腺癌發展過程中，逐漸下調的miR-34a不足以抑制c-MET表達，導致其部分活化，而促進胰腺癌發生。

綜上所述，miR-34a在胰腺癌中低表達，而其靶基因c-MET表達增高，兩者表達呈負相關，并與臨床分期及腫瘤分化程度高度相關。體外實驗表明過表達miR-34a或抑制c-MET后可顯著減弱胰腺癌細胞增殖及轉移活性，表明miR-34a的抑癌活性可部分通過抑制c-MET得以實現，miR-34a及c-MET有望成為胰腺癌新的診治靶點。