骨橋蛋白在大鼠慢性胰腺炎中的表達及意義

王域玲 安薇 李桂香 朱建偉 蔣斐

慢性胰腺炎(CP)是一種慢性不可逆性疾病，主要病理特征為胰腺纖維化、胰管擴張扭曲，探討胰腺纖維化相關(guān)因素有助于了解其發(fā)病機制并提供新的治療策略[1]。骨橋蛋白(osteopontin, OPN)是一種分泌性的酸性蛋白，與細胞外基質(zhì)形成、血管增生及組織損傷修復(fù)密切相關(guān)[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)OPN在纖維化的肝、腎及心臟組織中大量表達，與心肌纖維化、腎間質(zhì)纖維化及肝硬化密切相關(guān)[4-6]。在肝纖維化的研究中發(fā)現(xiàn)，OPN可激活肝星形細胞[7]，促進其表達過多的細胞外基質(zhì)如α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)及Ⅰ型膠原蛋白(collagen Ⅰ, ColⅠ)，抑制OPN的表達可減輕肝纖維化[6,8]。目前尚無有關(guān)OPN與CP及胰腺纖維化的報道，本研究通過構(gòu)建大鼠CP模型，探討OPN在CP大鼠胰腺中的表達及其與胰腺纖維化的關(guān)系。

材料與方法

一、動物分組與模型建立

健康雄性Wistar大鼠，體重180～200 g，由海軍軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供，清潔級。按數(shù)字表法隨機分為對照組和CP組，每組10只。采用單次尾靜脈注射二氯二丁基錫(DBTC，8 mg/kg體重)構(gòu)建CP模型[9-10]，以等容積無水乙醇及甘油尾靜脈注射為對照組。分別在造模前及造模后1、2、4、6周測量大鼠體重，造模6周處死大鼠，觀察胰腺大體形態(tài)，并取部分胰腺組織于-80℃保存，部分胰腺組織用4%多聚甲醛固定。

二、胰腺組織病理學(xué)檢查

取固定胰腺組織標本，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察胰腺組織病理改變。應(yīng)用Sirius Red染色評估胰腺纖維化程度，試劑盒購自Abcam公司，按說明書操作。每張切片取5個不連續(xù)低倍視野(×100)拍片，使用Image J軟件計算染色面積百分比，取均值[11]。

三、胰腺組織OPN、α-SMA及ColⅠ表達檢測

采用免疫組織化學(xué)法檢測大鼠胰腺組織OPN、α-SMA表達。OPN、α-SMA一抗均購于Abcam公司，工作濃度分別為1∶100、1∶200。酶標二抗購于上海長島生物試劑有限公司，應(yīng)用DAB染色。每張染色切片取5個不連續(xù)高倍視野(×200)進行評分，評分包括著色強度與陽性細胞比例，著色強度以無染色、淺黃色、棕黃色、棕褐色為0～3分，陽性細胞比例以0、1%～24%、25%～49%、50%～74%、≥75%為0～4分，兩評分相乘(0～12分)，取平均值為最終評分。0～2分為陰性，3～5分為弱陽性，6～8分為陽性，9～12分為強陽性。

取冷凍的胰腺組織，應(yīng)用蛋白裂解液裂解，獲取組織總蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)含量(試劑盒購于碧云天公司)。取50 μg蛋白行常規(guī)蛋白質(zhì)印跡法檢測OPN、α-SMA及ColⅠ蛋白的表達，以GAPDH為內(nèi)參。OPN、α-SMA、ColⅠ抗體及HRP標記二抗均購于Abcam公司，工作濃度分別為1∶1 000、1∶300、1∶5 000、1∶5 000，GAPDH抗體購于上海康城生物科技有限公司，工作濃度為1∶5 000。最后用ECL(Millipore公司)化學(xué)發(fā)光法顯影。采用Image J軟件獲取條帶灰度值， 以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比作為蛋白相對表達量。實驗重復(fù)3次，取均值。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、大鼠體重變化及胰腺組織病理學(xué)改變

CP組大鼠存活率為70%(7/10)，對照組大鼠存活率為100%。造模2、4、6周CP組大鼠體重均顯著低于對照組[(221.89±2.51)g 比(237.36±7.80)g，P<0.05；(223.29±3.09)g比(266.05±6.26)g，P<0.01；(223.26±3.57)g比(276.93±6.82)g，P<0.01]。6周處死大鼠，肉眼見CP組胰腺組織呈暗黃色，與周圍組織粘連，可見囊性病灶，未見出血、壞死。對照組無明顯改變。鏡下見CP組胰腺小葉間大量纖維組織增生，腺泡細胞空泡樣變性壞死，小葉間大量炎癥細胞浸潤，胰管擴張。對照組僅有細胞水腫、脈管周圍少許纖維組織(圖1)。

圖1 對照組(1A)及CP組(1B)胰腺組織病理改變(HE ×400)

二、 胰腺組織纖維化程度

Sirius-Red染色后CP組胰腺組織有大量鮮紅色條索狀及網(wǎng)狀膠原纖維沉積于小葉間隙和腺泡間，而對照組僅在血管及胰管周圍有少許纖維沉積(圖2)。CP組染色面積顯著大于對照組[(51±11)%比(9±4)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

三、胰腺組織OPN、α-SMA及ColⅠ的表達

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，CP組OPN主要表達在腺管上皮、腺泡細胞胞質(zhì)及纖維結(jié)締組織內(nèi)，對照組僅有少量表達在血管及胰管周圍的纖維結(jié)締組織內(nèi)，腺泡細胞低表達(圖3)。CP組7只大鼠中3只胰腺組織OPN強陽性表達，4只陽性表達；對照組10只大鼠中3只胰腺組織OPN弱陽性表達，7只陰性表達，CP組OPN的表達明顯高于對照組(Z=-5.170，P<0.01)，且OPN表達與Sirius-Red染色面積呈正相關(guān)(r=0.790，P<0.01)。

圖2 對照組(2A)及CP組(2B)胰腺組織膠原沉積(Sirius-Red染色 ×100)

圖3 對照組(3A)及CP組(3B)胰腺組織OPN表達(免疫組織化學(xué) ×200)

CP組大鼠胰腺組織α-SMA表達在纖維結(jié)締組織聚集處，腺管上皮及腺泡細胞內(nèi)不表達，而對照組大鼠胰腺組織α-SMA陰性表達(圖4)。

圖4 對照組(4A)及CP組(4B)胰腺組織α-SMA表達(免疫組織化學(xué) ×200)

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，CP組OPN、α-SMA及ColⅠ的表達量均顯著高于對照組(0.70±0.22比0.24±0.11，P<0.05；0.71±0.10比0.06±0.01，P<0.01；2.83±1.42比0.39±0.07，P<0.05；圖5)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖5 對照組(1)及CP組(2)胰腺組織OPN、α-SMA及ColⅠ蛋白表達(蛋白質(zhì)印跡法)

討 論

目前建立CP大鼠模型有多種方法，如飲食誘導(dǎo)、腹腔內(nèi)注射雨蛙素、胰腺導(dǎo)管結(jié)扎、胰管內(nèi)注射牛黃膽酸鈉、靜脈注射DBTC或內(nèi)毒素以及轉(zhuǎn)基因模型等方法[12]，其中單次靜脈注射DBTC較為安全、簡單，成模率達80%左右[10]。該模型制模后1周就可觀察到胰腺實質(zhì)出現(xiàn)炎癥細胞浸潤及膠原纖維沉積，其機制可能是DBTC破壞腺泡細胞及導(dǎo)管上皮細胞誘導(dǎo)胰腺發(fā)生炎性改變，壞死細胞阻塞胰管導(dǎo)致胰管擴張、小葉結(jié)構(gòu)破壞最終造成了間質(zhì)纖維化。該模型以外分泌實質(zhì)破壞和纖維化為特征，后期出現(xiàn)內(nèi)分泌實質(zhì)的破壞[13]，無胰腺實質(zhì)萎縮，廣泛用于CP纖維化機制的研究[14-16]。本研究采用單次尾靜脈注射DBTC成功建立了CP纖維化大鼠模型，除麻醉意外死去1只，注射藥物24 h內(nèi)死亡2只外，成活的7只大鼠均建模成功，鏡下觀察到小葉間大量纖維組織及炎癥細胞浸潤，腺泡細胞出現(xiàn)變性及壞死，胰管擴張；Sirius-Red染色面積顯著增加；α-SMA及ColⅠ表達明顯上調(diào)，提示胰腺纖維化程度較重。

OPN是一種細胞外基質(zhì)細胞因子，也被稱為分泌型磷酸蛋白 1，主要表達在結(jié)締組織及纖維組織中[17]。研究顯示，下調(diào)OPN可減輕甚至消除小鼠肝纖維化[8]，也可以減少擴張性心肌病中左心室的重建[18]。OPN參與纖維化的機制可能通過激活TGF-β[19]、PI3K/Akt[20]或FAK/Akt[18]等信號通路誘導(dǎo)纖維化的發(fā)生。Chen等[6]體外實驗發(fā)現(xiàn)OPN通過競爭性抑制肝星形細胞的miR-129-5p在ColⅠ RNA上的結(jié)合位點，解除miR-129-5p對ColⅠ表達的抑制作用從而上調(diào)ColⅠ的表達。Rychlikova[21]等檢測了CP及正常人外周血OPN水平，發(fā)現(xiàn)CP患者的水平顯著高于對照組，特別是伴有鈣化或結(jié)石的患者。本研究結(jié)果顯示，CP大鼠胰腺組織OPN的表達均顯著高于對照組，且其表達水平與胰腺纖維化程度呈正相關(guān)，說明OPN表達與胰腺纖維化有關(guān)。OPN如何引起胰腺發(fā)生纖維化、OPN與胰腺星形細胞活化有何聯(lián)系、以O(shè)PN為靶點進行治療對胰腺纖維化有何影響是今后需要進一步研究探討的方向。