酵素食品發酵工藝研究

高小躍，楊紅澎，張 怡，童應凱

(天津農學院農學與資源環境學院生物技術系 天津300384)

0 引 言

近年來，在日本和我國，酵素已成為電視、廣播、新聞等的熱門話題，成為保健食品的新寵。酵素是一類特殊的具有催化功能的復雜蛋白質，部分由人體自身合成，部分由飲食補充[1]。新型酵素食品是指通過合理選擇食材、益生菌和發酵工藝，可分別形成一種或多種神奇功效，包括：調整免疫應答、抗癌、整腸、消除便秘、減肥、抗過敏等，作為具有生命活力的獨特保健品，酵素有著巨大的養生前景。

紅薯，學名甘薯，原產于美洲，是世界上公認的物美價廉、糧菜兼用、老少皆宜的健康綠色食品。紅薯味道甜美，富含碳水化合物，膳食纖維，胡蘿卜素，多種維生素以及鉀、鎂、銅、硒、鈣等多種礦物質，具有抗癌防癌，防治高血壓、動脈硬化，降低膽固醇，治療便秘的作用[2]。因此，研究新型紅薯食品是非常必要的。

酸棗仁是鼠李科植物酸棗的干燥成熟種子，分布于我國西北、東北、華北及南方一些地區。酸棗仁具有補肝、寧心、斂汗、生津的功效，用于治療虛煩不眠、驚悸多夢、體虛多汗及津傷口渴[3]。因為酸棗仁鎮靜催眠的顯著功效，使其受到了越來越廣泛的關注，酸棗仁食品越來越受歡迎。

作為未來的保健品新星，酵素食品的發展前景遠大，市場價值較高。由于我國對于酵素產品的研究起步較晚，國內沒有針對酵素產品出臺相關技術標準和質量檢測等，導致市面上酵素產品質量參差不齊[4]。本文主要對以紅薯、酸棗仁為主要原料的一種新型酵素食品的發酵工藝研究開展研究，確定其最佳發酵工藝條件，為大規模生產該類酵素食品提供借鑒，真正讓酵素食品作為保健食品走進人們的生活。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與菌種

原料：市售紅薯、酸棗仁。

菌種：尚川酵素益生菌菌粉；植物乳桿菌；干酪乳桿菌；副干酪乳桿菌(佛山市樂伴貿易有限公司)。

1.1.2 培養基

MRS培養基：蛋白胨 10.0,g，牛肉粉 5.0,g，酵母粉4.0,g，葡萄糖20.0,g，吐溫80 1.0,mL，磷酸氫二鉀2.0,g，醋酸鈉 5.0,g，檸檬酸三銨 2.0,g，硫酸鎂 0.2,g，硫酸錳 0.05,g，瓊脂 15.0,g，pH 值 6.2，121,℃高壓滅菌 40,min。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵素發酵工藝路線

紅薯→洗凈去皮、切塊→榨汁→ 過濾→分裝→滅菌→接種→發酵

酸棗仁→粉碎→烘干→加水煮沸→過濾→分裝→滅菌→接種→發酵

1.2.2 實驗材料前處理方法

1.2.2.1 紅薯前處理方法

紅薯洗凈去皮后，切小塊，放入榨汁機中，按紅薯∶水為 1∶10比例榨汁；采用 32層紗布過濾，除去紅薯渣，按 100,mL/杯分裝入三角瓶中，于 121,℃高壓滅菌 20,min；滅菌結束，待培養基晾涼后，按正交實驗表(見表1)進行接種發酵。

1.2.2.2 酸棗仁前處理方法

酸棗仁于粉碎機中粉碎約 1～2,min，取粉末放入烘箱85,℃烘干8,h，按酸棗仁粉末∶水為1∶25比例煮沸5,min，采用 32層紗布過濾，除去粉末，按100,mL/杯分裝入三角瓶中，于121,℃高壓滅菌20,min；滅菌結束，待培養基晾涼后，按正交實驗表(如表1)進行接種發酵。

表1 L9(34)實驗因素水平表Tab.1 Factors and levels of L9(34)orthogonal experiment

1.2.3 測定方法

1.2.3.1 感官

觀察外觀、香氣、整體口感。

1.2.3.2 測定活菌(乳酸菌)總數

將發酵好的液體樣品充分搖勻后，用無菌移液管吸取樣品 25,mL放入裝有 225,mL無菌水的無菌三角瓶中，充分振搖，制成1∶10的樣品勻液。

用1,mL微量加樣器吸取1∶10樣品勻液1,mL，緩慢注入裝有 9,mL無菌水的無菌試管中(吸管尖端不要觸及稀釋液)，振搖試管，換用 1支無菌吸管反復吹打使其混合均勻，制成 1∶100的樣品勻液。另取 1支微量加樣器槍頭，按上述操作順序，做 10倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋1次，即換用1次槍頭。

根據樣品活菌總數的估計，選擇 2～3個連續的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取 0.1,mL樣品勻液分別置于 3個 MRS瓊脂平板，使用涂布器進行表面涂布。37,℃，厭氧培養 24,h后計數平板上的所有菌落數。從樣品稀釋到平板涂布要求在超凈工作臺內遵循無菌操作，15,min內完成。

1.2.3.3 pH值的測定

pH電極使用前用純水沖洗，用紙吸干水分，電極連接于儀表上，接通電源，開機。

校準：電極放入任意一pH緩沖液中，校準，判斷讀數穩定后，按確認完成一點校準；放入第 2個緩沖液按校準繼續兩點校準。

測量：用滴管吸取無菌水反復沖洗電極 3 次，用濾紙吸干表面液體，插入發酵好的液體樣品中進行測定，判斷讀數穩定后，按確定鍵讀數，記錄數值。

1.2.3.4 超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定

超氧化物歧化酶，簡稱 SOD。SOD 一類催化超氧陰離子自由基發生歧化反應，消除體內超氧陰離子自由基，消除活性氧毒性，保護機體不受超氧陰離子自由基攻擊的特殊金屬酶。研究表明，具有 SOD酶的保健品具有良好的抗衰老、抗疾病、抗癌、抗疲勞和保健強身的功效[5]。

鄰苯三酚方法原理：鄰苯三酚在酸性環境中穩定，但在弱堿性環境中會發生自氧化反應，鄰苯三酚在自氧化時只接受一個電子生成超氧陰離子自由基(O2+O2-)，并在其自氧化過程中以一定速率生成有色中間物，SOD 可以將 O2-歧化分解成 H2O2和 O2，從而抑制了鄰苯三酚的自氧化速率。每分鐘反應液中SOD抑制50%,反應速率時即為SOD活力單位[6]。

制備樣品提取物溶液：分別量取 100,μL的樣品溶液于 EP管中，加入 1,mL的 DMSO，充分溶解，備用。

0.1,mol/L tris溶液：稱tris 1.211,g加少許蒸餾水溶解，定容至100,mL。

0.1,mol/L HCl溶液：量濃鹽酸 50,μL 定容至50,mL。

tris-HCl緩沖液：量取50,mL的0.1,mol/L tris溶液與20,mL的0.1,mol/L HCl溶液混合，用濃鹽酸調pH值到8.2，再用蒸餾水定容至100,mL。

7,mmol/L C6H6O3溶液：稱 C6H6O30.441,4,g加水定容至100,mL。

試驗中樣品組為 10,μL的樣品提取物溶液加入3,mL pH 值為 8.2的 tris-HCl緩沖液，25,℃水浴20,min，加入 7,mmo1/L的鄰苯三酚溶液 3,mL，反應4,min后加入 28,μL 12,mmol/L的鹽酸終止反應；空白組中不加樣品，其余與樣品組相同，樣品空白組不加鄰苯三酚并以水代替。以 tris-HC1緩沖液為對照在 420,nm測吸光度值。根據抑制率判斷樣品對 O2-清除的能力。每份樣品重復測定3次。

式中：V1反應液總體積；V2測定樣品體積；n樣品稀釋液倍數。

2 結果與分析

2.1 感官分析

外觀、香氣、整體口感如表2所示。

表2 感官結果Tab.2 Sensory results

2.2 正交實驗結果

由于本實驗以活菌數高，SOD活性高為最終目標，所以觀測指標是以活菌數量和SOD酶活性為主。正交試驗中加糖量是為了調節酵素口感，因此，考慮溫度、時間、接種量3個因素的影響，活菌數以及SOD活性測定數據如表3所示。

表3 紅薯酵素正交實驗結果Tab.3 The results of sweet potato enzyme from L9(34)orthogonal experiment

2.2.1 紅薯酵素正交實驗結果

各個因素的離差平方和 Si反映了各因素對試驗結果的影響，由表3可知，對于 SOD酶活力而言，SA＝0.007,1，SB＝0.000,1.SC＝0.007,6，SC＞SA＞SB。對活菌總數而言，SA＝0.169,1，SB＝0.002,6，SC＝0.237，SC＞SA＞SB。即影響因素順序為接種量影響最大，發酵溫度影響次之，時間影響較小。

分析表4、表5。取臨界值 F0.05和 F0.10之間的作為顯著性判斷標準，對于 SOD 酶活力，F0.05＞F0.10＞FA，F0.05＞F0.10＞FB，FC＞F0.05＞F0.10，對于活菌總數，FA＞F0.05＞F0.10，F0.05＞F0.10＞FB，FC＞F0.05＞F0.10，由方差分析可知，因素 A、B、C 對實驗結果都有顯著影響，其中，C因素影響特別顯著，因素 A、B次之。對于因素 D，因紅薯中富含碳水化合物，加糖量為2%,時，口感較佳，即可滿足大多數人口感。

表4 紅薯酵素SOD酶活力方差分析表Tab.4 Variance analysis of SOD enzyme activity of sweet potato enzyme

表5 紅薯酵素活菌總數方差分析表Tab.5 Analysis table of variance of total number of yeast living bacteria

2.2.2 酸棗仁酵素正交實驗結果

由表6中 Si值可知，對于 SOD酶活力而言，SA＝19.97，SB＝3.25，SC＝39.5，SC＞SA＞SB，即影響因素順序為接種量影響最大，發酵溫度影響次之，時間影響較小。對活菌總數而言，SA＝0.240,4，SB＝0.004,6，SC＝0.208,6，SA＞SC＞SB。即影響因素順序為發酵溫度影響最大，發酵接種量影響次之，時間影響較小。

表6 酸棗仁酵素正交實驗結果分析Tab.6 The results of jujube kernel enzyme from L9(34)orthogonal experiment

分析表7、表8。取臨界值 F0.05和 F0.10之間的數值作為顯著性判斷標準，對于 SOD 酶活力，F0.05＞F0.10＞FA，F0.05＞F0.10＞FB，F0.05＞F0.10＞FC，對于活菌總數，FA＞F0.05＞F0.10，F0.05＞F0.10＞FB，FC＞F0.05＞F0.10，由方差分析可知，因素A、B、C對實驗結果都有顯著影響，其中，A因素影響特別顯著，因素C、B次之。由于因素A、C顯著性均大于B，因子A、C應選擇活菌數及SOD值最高的A3、C3，因子B雖然在 B1時 SOD酶活最高，但與 B2時相差不多，而B2時活菌數最高，所以選擇 B2，對于因素 D，在加糖量為4%,時，口感適中。

表7 酸棗仁酵素SOD酶活力方差分析表Tab.7 Variance analysis of SOD enzyme activity of jujube kernel enzyme

表8 酸棗仁酵素活菌總數方差分析表Tab.8 Variance analysis of the total number of active bacteria of jujube kernel enzyme

3 結 論

綜合方差分析及整體感官，紅薯酵素的發酵工藝條件為：溫度42,℃，發酵時間8,h，接種量為1.5%，加糖2%；配料比紅薯∶水為1∶10。酸棗仁酵素的發酵工藝條件為：溫度 42,℃，發酵時間 8,h，接種量為1.5%，加糖4%；配料比酸棗仁粉∶水＝1∶25。