蒼術酮對急性肺損傷小鼠保護作用的研究

陳天陽，劉廷亮，侯天祿，平 鍵，胡毅翔，成 揚，陳建杰

(1.上海市浦東新區傳染病醫院，上海 201299；2.上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海 201203；3.上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心，上海 200127；4.浙江省醫學科學院/浙江省實驗動物與安全性研究重點實驗室，浙江 杭州 310013)

急性肺損傷是一種由直接因素或間接因素導致的急性缺氧性呼吸功能不全，其重癥表現為急性呼吸窘迫綜合征[1]，并且病死率較高。目前尚無治療急性肺損傷的特效藥物和手段，臨床主要以支持治療為主，因此，探索尋找新的藥物來治療急性肺損傷是非常緊要的。從傳統中草藥中尋找新的有效成分，或者在已知的有效成分中探索尋找新的藥理作用是一個重要方向[2]。蒼術用于治療呼吸道疾病已經數千年[3],其所含化學成分較復雜，藥理活性較廣泛，但蒼術提取物及其活性成分對急性肺損傷的作用和機制尚不明確。本研究觀察了蒼術提取物蒼術酮對急性肺損傷小鼠肺組織病理、肺指數以及生存率的影響，旨在為其臨床應用提供理論依據。

1 實驗資料

1.1動物 雄性SPF級ICR小鼠，體質量(22±2)g，由浙江省實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(浙)2014-0001。

1.2藥物 中藥蒼術購自華東藥業公司(上海)，由浙江中醫藥大學鑒定，標本(編號：y20141022)存放在浙江醫學院藥學系。

1.3蒼術酮的提取與分離 采用HA121的超臨界液體萃取儀(華安儀器廠，江蘇，中國)進行超臨界二氧化碳萃取。取蒼術飲片100 g粉碎成粉末，置于萃取釜內，在350 bar壓力、50 ℃條件先動態提取60 min，乙醇(99.9%)作為改性劑，流速為5 mL/min。超臨界二氧化碳流速設定為15 g/min，靜態萃取時間設定為30 min。去除溶劑，得到的產物濃度為5.8%。用于體外研究的超臨界二氧化碳萃取物溶于磷酸鹽緩沖液，濃度為1 mg/mL。將超臨界二氧化碳萃取物(50 g)用于硅膠柱，使用石油醚(沸點60～90 ℃)和乙酸乙酯(30∶1→1∶1，V/V)進行分離。首先制備色譜柱：稱取硅膠40 g，將硅膠與洗脫劑按比例混合(20∶1)，攪拌除去空氣泡，徐徐傾入色譜柱中，不能留有氣泡，然后加入石油醚將附著在管壁的硅膠洗下，使色譜柱面平整，平衡1 h后加入供試品進行洗脫。將萃取物溶于石油醚中，沿著色譜柱管壁緩慢加入，當液面下降至與柱表面相平時，即從色譜柱頂端沿管壁緩慢加入洗脫劑石油醚，打開底閥，控制流速為1 mL/min，當流過色譜柱的一個空體積后即用標號的試劑瓶開始收集。得到化合物4(6 mg)、化合物3(2 mg)、化合物5(50 mg)、化合物6(4 mg)、化合物1(10 mg)和化合物2(13 mg)。采用紫外光譜、質譜分析、1H和13C核磁共振光譜鑒定，上述化合物分別為α-姜黃烯(6 mg)、蒼術醇(2 mg)、蒼術酮(50 mg)、蒼術呋喃烴(4 mg)、蒼術內酯I(10 mg)、蒼術內酯Ⅲ(13 mg)。將蒼術酮低溫(-18 ℃)避光保存，備用。

1.4試劑與儀器 甲型流感A/PR/8/34病毒(H1N1亞型)和A/深圳/203/2001(H3N2亞型)由浙江省疾病預防控制中心保存；利巴韋林，上?，F代哈森(商丘)藥業有限公司；HA121超臨界液體萃取儀，江蘇華安儀器廠產品。

1.5實驗方法

1.5.1實驗一 取144只雄性SPF級ICR小鼠，體質量(22±2)g，隨機選擇24只作為正常組，其余小鼠在乙醚麻醉下通過鼻內接種甲型流感病毒誘導感染制作病毒性肺炎模型，然后隨機分為模型組、利巴韋林組、蒼術酮高劑量組、蒼術酮中劑量組和蒼術酮低劑量組，每組24只。造模2 h后，蒼術酮高、中、低劑量組分別給予40 mg/kg、20 mg/kg、10 mg/kg蒼術酮灌胃，利巴韋林組給予50 mg/kg利巴韋林灌胃，正常組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，均每日1次，共5 d。實驗結束后每組隨機取10只小鼠處死，切除全肺并稱質量，計算肺指數和肺指數抑制率。肺指數=小鼠肺質量/小鼠體質量，肺指數抑制率=(模型組肺指數-干預組肺指數)/模型組肺指數×100%。然后將肺組織固定在10%中性福爾馬林緩沖溶液中固定處理，石蠟包埋，切成4 μm切片，根據標準流程進行脫蠟和水化，切片進行HE染色，鏡下觀察肺組織病理變化。

1.5.2實驗二 另取120只雄性SPF級ICR小鼠，體質量(22±2)g。造模、分組及干預同實驗一，每組20只。灌胃5 d后繼續觀察，統計第15天各組小鼠的存活情況，并計算存活時間。

2 結 果

2.1各組小鼠肺指數和肺指數抑制率比較 模型組肺指數明顯高于正常組(P<0.05)，利巴韋林組和蒼術酮各組肺指數均明顯低于模型組(P均<0.05),且利巴韋林組和蒼術酮高劑量組明顯低于蒼術酮低劑量組(P均<0.05)；利巴韋林組和蒼術酮高劑量組肺指數抑制率明顯高于蒼術酮低劑量組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠肺指數和肺指數抑制率比較

注：①與模型組比較，P<0.05；②與蒼術酮低劑量組比較，P<0.05。

2.2各組小鼠肺組織病理學表現 HE染色顯示，與模型組比較，各給藥組肺組織肺泡明顯，細胞相對較完整，炎性滲出減少，肺細胞間隔增厚較輕，細支氣管上皮柱狀細胞脫落減少。各組染色表現見圖1～6。

2.3各組小鼠生存情況 正常均存活；模型組存活3只(15%)，存活時間(7.9±2.8)d；利巴韋林組存活10只(50%)，存活時間(11.1±3.1)d；蒼術酮低劑量組存活6只(30%)，存活時間(9.3±3.6)d；蒼術酮中劑量組存活11只(55%)，存活時間(11.2±3.3)d；蒼術酮高劑量組存活14只(70%)，存活時間(12.4±2.6)d。利巴韋林組和蒼術酮各組小鼠生存率明顯高于模型組，存活時間顯著長于模型組，且蒼術酮高劑量組生存率明顯高于蒼術酮低劑量組，存活時間顯著長于蒼術酮低劑量組，差異均有統計學意義(P均<0.05)。

圖1 正常組小鼠肺組織HE染色表現(×200)

圖2 模型組小鼠肺組織HE染色表現(×200)

圖3 利巴韋林組小鼠肺組織HE染色表現(×200)

圖4 蒼術酮低劑量組小鼠肺組織HE染色表現(×200)

圖5 蒼術酮中劑量組小鼠肺組織HE染色表現(×200)

圖6 蒼術酮高劑量組小鼠肺組織HE染色表現(×200)

3 討 論

甲型流感病毒感染后，會引起紅細胞凝集和單核細胞浸潤，造成肺部大量炎性細胞浸潤而損傷正常細胞的結構和功能，從而引起病毒性肺炎，表現為支氣管上皮細胞脫落，管壁血管擴張充血、炎性細胞浸潤，肺泡壁毛細血管擴張充血、大量單核細胞浸潤[4]。目前，甲型流感病毒造成的急性肺損傷病死率很高，但是尚無可行、有效的治療方法[5-6]。

蒼術為菊科植物茅蒼術Atractylodeslancea(Thunb.)DC.或北蒼術Atractylodeschinensis(DC.)Koidz.的干燥根莖[7]，味辛、苦，性溫，具有燥濕健脾、祛風散寒的功效，其作為許多中藥方劑的組成部分，自古以來廣泛應用于臨床?，F代藥理作用顯示蒼術具有抗炎、降血糖、抗缺氧、抗菌、抗病毒、保肝等作用[8]。蒼術屬植物的化學成分主要有揮發油、苷、糖、黃酮及甾醇、營養物質等，揮發油由一系列倍半萜和聚乙烯炔類及少量酚類和倍半萜內酯等組成，倍半萜主要成分為β-桉葉醇(β-Eudesmol)、茅術醇(Hinesol)和蒼術酮(Atractylon)等[9]，其中蒼術酮具有抗流感病毒的作用[10]。為此本實驗觀察了蒼術酮對甲型流感病毒誘導的肺損傷保護作用，探討其用于臨床甲型流感病毒感染治療的價值。

本實驗觀察到，模型組肺指數明顯高于正常組，利巴韋林組和蒼術酮各組肺指數均明顯低于模型組,且利巴韋林組和蒼術酮高劑量組明顯低于蒼術酮低劑量組；各給藥組肺組織肺泡明顯，細胞相對較完整，炎性滲出減少，肺細胞間隔增厚較輕，細支氣管上皮柱狀細胞脫落減少；利巴韋林組和蒼術酮各組小鼠存活時間顯著長于模型組，生存率明顯高于模型組，且蒼術酮高劑量組存活時間顯著長于蒼術酮低劑量組，生存率明顯高于蒼術酮低劑量組。提示蒼術酮對甲型流感病毒所誘導的急性肺損傷具有保護作用，能夠明顯減輕肺部炎癥，可延長小鼠存活時間，提高生存率，且呈劑量依賴性，為其臨床應用提供了一定實驗依據，但其具體作用機制仍需進一步研究。