Survivin在不同TNM分期肝細胞癌組織中的表達及意義

黨存曙，王 涵，劉大鵬，劉志春，邊 佺

(1.中國石油天然氣集團公司中心醫院，河北 廊坊 065000；2.天津醫院，天津 300211)

原發性肝癌多起病隱匿，預后較差，是目前世界上癌癥相關死亡的第二大惡性腫瘤[1]。據統計，全球每年新發原發性肝癌約748 300例，死亡695 900例，新發與死亡病例中的50%以上發生在中國[2]。肝細胞癌是肝癌中最主要的病理類型，生存率極低。生存素(Survivin)是近年發現的抑制蛋白家族新成員，可抑制細胞凋亡，具有調節細胞有絲分裂、促進腫瘤血管生長等功能，密切影響著腫瘤的分化及增殖[3]。研究發現，Survivin在結腸癌[4]、甲狀腺癌[5]、肺癌[6]等多種腫瘤中異常表達，在肝癌組織及外周血中的表達也有報道[7]。本研究通過檢測Survivin在不同TNM分期原發性肝癌組織、癌旁組織中的表達情況，探討了其與肝細胞癌分期的關系，旨在為肝細胞癌的化學診斷提供更多參考依據。

1 臨床資料

1.1組織標本來源 收集2011年9月—2016年12月于中國石油天然氣集團公司中心醫院行肝癌手術切除且病理分型為肝細胞癌的40例患者癌組織及其對應的癌旁組織標本，其中男31例，女9例；年齡33～70(51.42±8.33)歲；TNM臨床分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期14例，Ⅲ期11例，Ⅳ期4例；患者術前均未進行放化療等抗腫瘤治療，癌旁組織為癌灶旁2～3 cm的肝臟組織，部分標本為肝硬化組織。另取同期因肝臟損傷手術或肝血管瘤手術切除的10例患者正常肝組織標本作為對照，其中男8例，女2例；年齡32～69(51.45±8.38)歲。

1.2試劑及儀器 一抗Survivin兔抗人單克隆抗體及免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗購自美國羅氏公司。

1.3研究方法 采用免疫組織化學法檢測Survivin在各期癌組織、癌旁組織及正常肝組織中的表達。

1.3.1組織標本切片制作 術后組織標本經含4%多聚甲醛的磷酸緩沖鹽(PBS)溶液灌流，于4 ℃下固定2h后，放入同溫度下4%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液中脫鈣，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后常規石蠟包埋，4 μm連續切片。

1.3.2免疫組化染色 常規烤片、脫蠟至水、室溫冷卻，PBS封閉15 min，山羊血清封閉15 min，一抗(Survivin 濃度為1∶100)4 ℃冰箱孵育過夜，次日PBS沖洗，滴加二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色、復染、脫水、透明、干燥封片。以PBS代替一抗作陰性對照，光學顯微鏡下觀察、計數并攝片。

1.4結果判定標準 所有切片由2名經驗豐富的病理科醫師進行評價，意見不一致時協商統一。①陽性細胞計分標準：隨機選取每張切片的5個高倍視野觀察，Survivin表達于肝細胞的胞核及胞漿，以陽性細胞表達數≤5%計0分，5%<陽性表達細胞數≤25%計1分，25%<陽性細胞數≤50%計2分，50%<陽性表達細胞數≤75%計3分，陽性表達細胞數>75%計4分。②染色強度計分：細胞不著色計0分，細胞著色為淺黃色計1分，細胞著中黃色或棕色且無背景著色計2分，細胞著深棕色或棕褐色且無背景著色計3分。③依據兩項計分數值相乘結果判斷切片染色的陽性等級：0～1分為陰性，2～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性()，9～12分為強陽性()。切片陽性表達率(%)=陽性(弱陽性+陽性+強陽性)表達例數/總例數×100%。

1.5統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件分析數據。計數資料以例(%)表示，率的比較采用2檢驗，趨勢檢驗應用趨勢2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1Survivin在肝細胞癌組織、癌旁組織及正常肝組織中的表達情況 Survivin在正常肝組織中未見表達(見圖1)；在癌旁組織表達較少(見圖2)，陽性表達率為27.5%(11/40)；在肝細胞癌組織中大量表達(見圖3)，陽性表達率為80.0%(32/40)。Survivin在肝細胞癌組織中的陽性表達率明顯高于正常肝組織及癌旁組織(P均<0.05)。

圖1 Survivin在正常肝組織的表達(DAB，×100)

圖2 Survivin在癌旁組織的表達(DAB，×100)

圖3 Survivin在肝細胞癌組織的表達(DAB，×100)

2.2Survivin在不同TNM分期肝細胞癌組織中的表達情況 Survivin在不同TNM分期肝細胞癌組織中均有陽性表達，見圖4～7；且隨著TNM分期的增加，Survivin陽性表達率呈逐漸增高的趨勢(P<0.05)，見表1。

圖4 Survivin在TNMⅠ期癌組織中的表達(DAB，×100)

2.3Survivin在不同TNM分期肝細胞癌對應癌旁組織中的表達情況 Survivin在不同TNM分期肝細胞癌癌旁組織中的陽性表達率隨分期的增加呈增高的趨勢(P<0.05)。見表2。

圖5 Survivin在TNMⅡ期癌組織中的表達(DAB，×100)

圖6 Survivin在TNM Ⅲ期癌組織中的表達(DAB，×100)

圖7 Survivin在TNM Ⅳ期癌組織中的表達(DAB，×100)

表1 Survivin在不同TNM分期肝細胞癌組織中表達情況 例(%)

表2 Survivin在不同TNM分期肝細胞癌對應癌旁組織中的表達情況 例(%)

3 討 論

原發性肝癌的發病率較高，其較低的早期確診率多使患者失去手術機會，而高復發轉移率大大降低了患者生存率[8]。目前原發性肝癌化學診斷的主要檢測指標是血清腫瘤標志物，其中甲胎蛋白(AFP)是廣泛應用的血清蛋白質腫瘤標志物之一，但因其靈敏度較低，在一些非腫瘤性肝病、生殖系統和胃腸道惡性腫瘤中也經常會異常升高，因此亟待發現新型的腫瘤標記物。

Survivin基因定位于染色體17q25，編碼產生一個分子質量為16.5 ku的結構獨特蛋白，表達在癌細胞中的胞漿及細胞核。Survivin僅有BIR結構域而無鋅指結構是其與抑制蛋白家族中其他蛋白的不同之處，其是目前發現的作用最強的凋亡抑制蛋白[9]。研究發現，Survivin致病機制可能與其調節PI3K/AKT通路，直接抑制凋亡酶(caspase)發揮抗凋亡作用，上調血管內皮生長因子(VEGF)表達，參與腫瘤血管形成等有關[10]，這些機制有效抑制了腫瘤細胞的凋亡，在腫瘤擴散、浸潤、發展過程中起到舉足輕重的作用。近年來研究發現腫瘤患者的生存率隨Survivin的高表達有降低趨勢，并且與化療抵抗、腫瘤復發和腫瘤患者生存期有關，因而該蛋白成為腫瘤分子靶向治療的目標之一[11]。

本研究結果發現，Survivin蛋白在肝細胞癌組織中的陽性表達率明顯高于癌旁組織及正常肝組織，且陽性表達率有隨肝癌TNM分期增加上升的趨勢，與Jin等[12]研究結果一致。原發性肝癌是原癌基因激活、抑癌基因受抑制、凋亡過程受阻等多因素共同作用所致，由此推測隨著肝癌的惡化，Survivin在癌組織中的表達逐漸增多，放大凋亡抑制作用，促進腫瘤惡化及擴散。另外Survivin在癌旁組織中的陽性表達率雖然明顯低于癌組織，但其陽性表達率也有隨著腫瘤分期的升高而有增高的趨勢，且Ⅳ期肝癌的癌旁組織中有明顯陽性()表達，或許表明雖然癌旁組織暫未發現異型性的腫瘤細胞，但頗具腫瘤特征的凋亡抑制改變已經產生,促進了腫瘤組織的局部擴散，癌旁組織的細胞功能特性已明顯不同于正常組織。Morinaga等[13]的研究表明，正常肝組織中Survivin有少量表達，而本研究中正常肝組織中未見Survivin表達，可能與這部分組織標本數量較少及手術取材部位選擇的偶然性有關。

綜上所述，Survivin在肝細胞癌組織中有大量表達，且隨腫瘤TNM分期的增加，其在癌組織及癌旁組織中的陽性表達率有增高的趨勢，為研究Survivin在肝細胞癌化學診斷方面應用的可能性提供了理論基礎及依據。