鼻腔黏膜修復敷料的生物學評價

李曉春，王莉芳，鄭 旭，徐長根

（陜西省食品藥品監督檢驗研究院，陜西 西安 710065）

《醫療器械監督管理條例》明確提出，國家對醫療器械按照風險程度實行分類管理。第一類是風險程度低，實行常規管理可以保證其安全、有效的醫療器械；第二類是具有中度風險，需要嚴格控制管理，以保證其安全、有效的醫療器械；第三類是具有較高風險，需要采取特別措施嚴格控制管理，以保證其安全、有效的醫療器械。根據2017年8月頒布的《醫療器械分類目錄》，鼻腔黏膜修復敷料屬于無源植入器械中的組織工程支架材料，屬Ⅲ類醫療器械。本研究中按照GB／T系列標準對3批鼻腔黏膜修復敷料進行了細胞毒性、遲發型過敏及刺激等生物學評價［1－4］。現報道如下。

1 材料與方法

1．1 材料

材料、藥品與試劑：鼻腔黏膜修復敷料分別選擇3個不同廠家生產的，每個廠家各選1批，共3批，記為A，B，C批。高密度聚乙烯（批號為K0M357，符合美國藥典標準）；氯化鈉注射液（批號為160130 3G，西安京西雙鶴藥業有限公司）；優級胎牛血清（批號為TBD21HY，天津市灝洋生物制品科技有限責任公司）；RPMI培養基（批 號 為 AB10125297，HyClone）；青 鏈 霉 素混合液（100 ×，批號為 20170503，Solarbio）；胰蛋白酶（批號為SLBP8607V，Sigma）；無菌磷酸鹽緩沖液（PBS，批號為05E16B21，武漢博士德生物工程有限公司）；濾器（0．22 μm，批號為 R6EA47847，Millipore）；二甲基亞砜（DMSO，分析純，批號為20171114，國藥集團化學試劑有限公司）；噻唑藍（MTT，批號為 MKBN7264V，Sigma）。

細胞及動物：細胞株［小鼠成纖維細胞（L929細胞），編號為CX0187，武漢博士德生物工程有限公司］；白化豚鼠（Dunkin Hartley）、新西蘭兔，均由西安市迪樂普生物資源開發有限公司提供，實驗動物生產許可證號為 SCXK（陜）2014－001。飼養環境為溫度22～26℃，相對濕度40% ～70%，實驗動物使用許可證號為SYXK（陜）2013－001，均由陜西省食品藥品監督檢驗研究院實驗動物管理委員會按照該院實驗動物福利倫理審查委員會章程批準實施。

儀器：BS2202S型電子天平（賽多利斯儀器有限公司）；BSP－250型生化培養箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；KA－1000型低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；SW－CJ－2F型醫用凈化工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；HF151型CO2培養箱（上海力康醫療設備有限公司）；XSZ－D2型倒置相差顯微鏡（重慶光學儀器廠）；Versa Max0310－3264型酶標儀（美國分子儀器有限公司）；LDZF－50KB－Ⅱ型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）。

1．2 方法

1．2．1 遲發型超敏反應封閉貼敷試驗［1，5］

健康、初成年普通級白化豚鼠，雌雄不限，體質量300～500 g，35只。30 只作為試驗組（A，B，C 組），每個樣品10只；5只作為對照組。試驗前，剔除豚鼠背部被毛。

誘導階段：試驗組用吸收性紗布浸透供試品原液1 mL，局部貼敷于每只動物的左上背部位。6 h后除去包扎帶和紗布。1周中連續3 d重復該步驟，同法操作3周。對照組以0．9%氯化鈉注射液同法操作。

激發階段：最后1次誘導貼敷后14 d，用供試品和0．9%氯化鈉注射液對全部動物進行激發。方法同上，貼敷于每只動物去毛的未試驗部位。6 h后除去包扎帶和紗布。

動物觀察：激發后24 h剃去激發部位及其周圍的被毛，溫水洗凈，擦干。脫毛后至少2 h，按Magnusson和Kligman分級對試驗部位評分，其中無明顯改變為0級，散發性或斑點狀紅斑為1級，中度融合性紅斑為2級，重度紅斑和水腫為3級。并在除去紗布后48 h進行再次評分。

1．2．2 體外細胞毒性試驗（MTT 法）［2－4，6］

試驗樣品及試液制備：無菌條件下將鼻腔黏膜修復敷料與含血清培養基按0．2 g／mL的比例于37℃浸提24 h后 2000r／min 離心 5 min，取上清液，得供試液。取高密度聚乙烯（厚度為1 mm）36 cm2，剪成5 mm×25 mm的小塊，加12 mL細胞生長培養液，37℃浸提24 h，過濾除菌，得陰性對照液。5%的DMSO溶液，過濾除菌，現用現配，得陽性對照液。同細胞生長培養液，得空白對照液。

細胞懸液制備：將已培養48～72 h生長旺盛的細胞用消化液消化后加入細胞培養液，吸管吹打，混勻，用血細胞計數板在顯微鏡下計數，按公式計算細胞密度，C＝ n／4×104，式中 C為細胞密度，單位為個 ／mL；n為計數板四角四大格內細胞總數，單位為個。根據實測細胞密度，加入適量細胞生長培養液配制成試驗要求密度的細胞懸液，備用。

方法：將配制好的細胞懸液接種于96孔培養板，設空白對照組、陰性對照組、陽性對照組和供試品組（A，B，C組），每組各設至少6孔，每孔接種100 μL細胞懸液。置CO2培養箱（含體積分數5%CO2氣體）37℃培養24 h后，棄去原培養液。空白對照組加入新鮮空白對照液，陰性對照組加入陰性對照液，陽性對照組加入陽性對照液，供試品組加入相應的供試液，每孔100 μL，置CO2培養箱繼續培養72 h后置顯微鏡下觀察細胞形態。每孔加入20 μL質量濃度為5 g／L的MTT溶液，繼續培養4 h后棄去孔內液體，加入150 μL DMSO，置振蕩器上振蕩10 min，在酶標儀570 nm和630nm波長下測定吸光度，按公式計算相對增殖率（RGR）。RGR＝A／A0×100%，式中 RGR為相對增值率（%），A為供試品組（陽性及陰性對照組）吸光度，A0為空白對照組吸光度。RGR按細胞毒性反應分級判定毒性反應分級，0級相對增殖率≥100%，1級相對增殖率為80% ～99%，2級相對增殖率為50% ～79%，3級相對增殖率為30% ～49%，4級相對增殖率為0～29%。

1．2．3 黏膜刺激試驗［1］

取健康、初成年普通級新西蘭兔，雌雄不限，體質量不低于2 kg。選取鼻腔無明顯刺激癥狀、無缺陷和無損傷的家兔12只，供試品組（A，B，C組）和對照組各3只。供試品組將受試物原液0．3 g涂抹至鼻腔內，24 h內不沖洗，對照組以0．9%氯化鈉注射液0．5 mL同法處理。每隔24 h重復上述操作，連續14 d。觀察記錄鼻腔黏膜刺激情況。末次接觸后24 h，無痛處死動物，解剖鼻腔組織，縱向切開，肉眼觀察黏膜組織的刺激情況。選取中央部位，經脫水、包埋、切片、HE染色，LEICA生物顯微鏡觀察［7］。按表1規定的計分系統對組織進行評分。試驗組動物顯微鏡評價計分相加后再除以觀察總數即得試驗組平均計分，最大計分為16分，對照組同法計算。試驗組平均計分減對照組平均記分即得刺激指數。刺激指數0分為無反應，1～4分為反應程度極輕，5～8分為反應程度輕度，9～11分為反應程度中度，12～16分為反應程度重度。

表1 鼻腔黏膜組織反應顯微鏡計分系統（分）

2 結果

2．1 遲發型超敏反應試驗結果

于激發后24 h及48 h觀察，供試品組及對照組中豚鼠的反應等級均為0，表明3批鼻腔黏膜修復敷料在本試驗條件下對豚鼠皮膚無致敏反應。結果見表2。

2．2 體外細胞毒性試驗結果

結果見表3。在本試驗室條件下，陽性對照組細胞毒性反應級別為3級，陰性對照組細胞毒性反應級別為0級，試驗系統有效。3批鼻腔黏膜修復敷料的細胞毒性反應級別均不大于2級，在標準可接受范圍內。

表3 細胞毒性試驗結果

2．3 黏膜刺激性試驗結果

病理檢查結果顯示，對照組黏膜層上皮結構完整，固有層可見極少量炎性細胞浸潤，少數血管充血及極輕度水腫，平均計分為2．33分；試驗組黏膜層上皮結構完整，固有層可見極少量炎性細胞浸潤，輕度血管充血及極輕度水腫，試驗組A批平均計分為4．0分，平均刺激指數為1．67；試驗組B批平均計分為5．33分，平均刺激指數為3．0；試驗組C批平均計分為4．67分，平均刺激指數為2．33。結果表明，在本試驗室條件下，3批鼻腔黏膜修復敷料均有極輕度黏膜刺激，病理檢查結果見圖1，反應計分及程度見表4。

圖1 各組家兔鼻腔黏膜組織HE染色圖（×100）

表4 黏膜刺激性試驗結果

3 討論

隨著鼻內鏡手術技術的提高和普及，鼻科學的發展進入了一個新時代，成為治療鼻疾病的主要手段之一。在提高治愈率的同時，術后填塞、止血、修復材料的選擇也至關重要，成為近年來鼻科學研究的發展方向［8］。本研究中的鼻腔黏膜修復敷料的主要成分是甲殼素［Chitin，（1，4）－2－乙酰氨基 －2－脫氧 －β－ D－葡萄糖］，是自然界中除纖維素外含量最豐富的天然多糖，也是除蛋白質外含量最豐富的含氮高分子，也是宇宙中唯一帶正電的陽性食物纖維，被科學界譽為“第六生命要素”，被歐美國家認定為機能性免疫物質［9］。基礎研究表明，甲殼素具有良好的生物相容性和生物可降解性，同時還具有促進傷口愈合、抗菌抗感染、止痛止血［10］，促進人體皮膚細胞（特別是角質細胞和成纖維細胞）的生長調節免疫、增強機體免疫、體內可降解等優點［11］。鼻腔黏膜修復敷料為水凝膠，柔軟、彈性好［12］，可與傷口更有效、嚴密接觸，能吸收大量傷口滲液，為傷口提供良好的濕潤環境，且不會造成敷料與創面之間的積液，更益于傷口愈合［13］。本研究中按照 GB／T16886及 GB／T14233的系列標準，對3批鼻腔黏膜修復敷料進行了生物安全性評價，結果顯示，無豚鼠皮膚致敏反應，對家兔鼻腔黏膜僅有極輕度刺激，細胞毒性不大于2級，均在標準規定的可接受范圍內。初步認為3批鼻腔黏膜修復敷料毒性較低，有望用于臨床。