超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定2型糖尿病大鼠血漿阿托伐他汀和沙格列汀的濃度

董 潔 ，湯道權(quán) ，肖冰心 ，王添艷 ，孫增先 △

（1．徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院·連云港市第一人民醫(yī)院，江蘇 連云港 222000； 2．徐州醫(yī)科大學(xué)，江蘇 徐州 221004）

沙格列汀（SAX）為二肽基肽酶（DPP－4）抑制劑，單一或與其他降糖藥聯(lián)合使用，可控制患者血糖［1］。3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶A（HMG－CoA）還原酶抑制劑（他汀類藥物）可降低2型糖尿病（T2DM）患者心血管事件風(fēng)險［2］。2013年版美國心臟病學(xué)院／美國心臟病協(xié)會（ACC ／AHA）指南推薦［3］，40 ～75 歲的 T2DM 患者需服用中等強度或高強度的他汀類藥物。沙格列汀經(jīng)肝臟代謝酶CYP3A4代謝生成5－羥基－沙格列汀（5－OH SAX）［4］，兩者都能選擇性抑制 DPP －4 活性，增強其降糖效果。阿托伐他汀（ATO）在體內(nèi)代謝也需要CYP3A4酶參與。目前尚未見報道沙格列汀及阿托伐他汀聯(lián)合用藥的相互作用，本研究中建立超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC－MS／MS）測定 ATO，SAX，5－OH SAX 的藥物濃度，用于T2DM大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究。現(xiàn)報道如下。

1 儀器、試藥與動物

儀器：Waters ACQUITY Sample Mange－FIN型液相色譜儀（美國 Waters公司）；AB Qtrap 4 500型質(zhì)譜儀，Analyst1．6．2數(shù)據(jù)處理軟件（美國 ApplicedBiosystems公司）；T1型氮氣發(fā)生器（德國普利賽斯公司）；AE－240型電子天平（瑞士梅特勒－托利多儀器有限公司）；Peqlab多功能高速離心機（德國Deutschland公司）；Vortex－genie 2漩渦混合器（美國ScientificIndustries公司）。

試藥：阿托伐他汀鈣（批號為20170320，純度為99．9%，浙江海正藥業(yè)股份有限公司）；沙格列汀水合物對照品（批號為 SG－31204001，純度為 94．36%，鄭州華文化學(xué)品有限公司）；5－羥基－沙格列汀（批號為20160303，純度為 95．6%），維格列汀（批號為 20151203，純度為99．5%），均由江蘇豪森藥業(yè)有限公司提供；乙腈（色譜純，美國Tedia公司）；醋酸銨（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；Millipore超純水。

實驗動物：SD大鼠，雄性，SPF級，體質(zhì)量80～120 g，購自上海西普爾－必凱實驗動物有限公司，許可證號為SCXK（滬）2013－0016，飼養(yǎng)于徐州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。所有動物實驗均按徐州醫(yī)科大學(xué)動物飼養(yǎng)和使用指南進行。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件與質(zhì)譜條件

色譜柱：WatersBEHShieldRP18柱（100mm×2．1mm，1．7μm）；流動相：10mmol／L 乙酸銨水溶液（A），乙腈（B），梯度洗脫，0～2．2 min，30% ～70%B，2．2～3．1 min，70% ～30%B，3．1 ～5．0 min，30%B；流速：0．2 mL ／min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

采用電噴霧電離源（ESI），以多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式掃描，正離子方式檢測。離子化電壓：5 500 V；溫度：350 ℃；噴霧氣（N2）壓力：60 psi；輔助加熱氣（N2）壓力：50 psi；氣簾氣體（N2）壓力：35 psi；碰撞氣模式：Medium；掃描時間：100 ms。用于定量分析的離子反應(yīng) m／z分 別為 559．3→440．2（ATO），316．2→180．2（SAX），332．3→196．2（5 －OH SAX），304．2→153．9（維格列汀，內(nèi)標）。

2．2 溶液制備與血漿樣品處理

對照品溶液：取ATO，SAX，5－OH SAX對照品，精密稱定，ATO用水－甲醇（50∶50）溶解并稀釋，SAX及5－OH SAX用水－乙腈（50∶50）溶解并稀釋，配成質(zhì)量濃度皆為1 g／L的混合對照品貯備液。用水－甲醇（50∶50）將ATO及5－OH SAX依次稀釋成質(zhì)量濃度為10，25，50，100，250，500，1 000，2 500，5 000 ng ／mL 的溶液，SAX 質(zhì)量濃度為 20，50，100，200，500，1 000，2 000，5 000，10 000 ng／mL 的對照品工作液。

內(nèi)標（IS）溶液：取維格列汀對照品，精密稱定，用水－乙腈（50∶50）溶解并稀釋，配成質(zhì)量濃度為1 g／L的內(nèi)標貯備液。臨用前，用水－甲醇（50∶50）稀釋定容至500 ng／mL。配置好的對照品貯備液及內(nèi)標貯備液置－20℃冰箱貯存，備用。

混合血漿樣品：取適量ATO，SAX，5－OH SAX標準工作液，加入空白血漿，配制成含ATO及5－OH SAX質(zhì)量濃度為 1，2．5，5，10，25，50，100，250，500 ng ／mL的溶液，SAX 質(zhì)量濃度為 2，5，10，20，50，100，200，500，1 000 ng／mL的系列混合血漿樣品溶液。同法制備定量下限、低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控血漿樣品溶液，即ATO及 5 － OH SAX（1，2．5，50，250 ng／mL），SAX（2，5，100，500 ng／mL），－20℃貯存，備用。

血漿樣品處理：取空白血漿50 μL，加入500 ng／mL內(nèi)標工作液 10 μL、乙腈 250 μL，渦旋振蕩 3 min，13 500 r／min離心10 min，移取上清液，在室溫下氮氣吹干。殘留物用100 μL水－甲醇（50∶50）復(fù)溶，渦旋振蕩1 min，13 500 r／min 離心 5 min，取上清液 10 μL，進樣。

2．3 方法學(xué)考察

專屬性考察：分別取6個SD大鼠空白血漿樣品；空白血漿加入ATO，SAX，5－OH SAX及內(nèi)標溶液；大鼠給藥0．5 h后收集血漿樣品，按照2．2項下血漿樣品操作，行 UPLC－MS／MS 分析，色譜圖見圖 1。ATO，SAX，5－OH SAX 及 IS的保留時間分別為 3．77，1．91，1．63，1．67 min，保留時間 1．01 min 處發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性物質(zhì)峰，但不干擾ATO，SAX，5－OH SAX及內(nèi)標溶液的測定，為了盡量減少內(nèi)源性物質(zhì)對儀器的污染，將1．40 min之前的組分切外，結(jié)果見圖1。

標準曲線制備及定量下限考察：取2．2項下混合血漿樣品溶液，按血漿樣品處理方法處理，并按擬訂色譜及MS條件進樣測定，記錄色譜圖。分別以待測物質(zhì)量濃度（X）為橫坐標、待測物峰面積與內(nèi)標峰面積比值（Y）為縱坐標，用加權(quán)（W＝1／X2）最小二乘法進行回歸運算。ATO 標準曲線為 Y＝0．00144X＋0．00742（r＝0．9986），定量限為1ng／mL；SAX標準曲線方程為 Y＝0．00466X＋0．002 12（r＝0．999 5），定量下限為 2 ng／mL；5－OH SAX 標準曲線方程為 Y＝0．009 07X＋0．000 473（r＝0．996 5），定量下限為 1 ng／mL。結(jié)果表明，ATO，SAX，5－OH SAX 質(zhì)量濃度在 1～500，2～1 000，1～500 ng／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

1．ATO 2．SAX 3．5 － OH SAX 4．IS A．空白血漿 B．空白血漿加入ATO，SAX，5－OH SAX及IS C．SD大鼠灌胃ATO，SAX 0．5 h后的血漿樣品加IS

精密度及準確度試驗：分別制備含 ATO，SAX，5－OH SAX定量下限、低、中、高4個質(zhì)量濃度的混合QC血漿樣品溶液，各5份，按2．2項下方法處理，進樣測定，并記錄色譜圖。連續(xù)測定3 d。采用當(dāng)日所建立的標準曲線計算樣品測定濃度，根據(jù)測定值與實際值進行計算，考察方法的精密度與準確度。結(jié)果顯示，3 d內(nèi)、日間 RSD＜9．34%，準確度為92% ～110%，符合生物樣品分析的要求。結(jié)果見表1。

表1 ATO，SAX，5－OH SAX日內(nèi)及日間精密度與準確度實驗結(jié)果

提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)試驗：取ATO，SAX，5－OH SAX混合QC血漿樣品（n＝5），按2．2項下方法操作，進樣分析，記錄相應(yīng)分面積（A）。取空白血漿 50 μL，加入乙腈250 μL，渦旋，離心，吹干上清液，在殘渣中加入5 μL 含 ATO，SAX，5－OH SAX 的混合標樣溶液（濃度與相應(yīng)的質(zhì)控樣品一致），10 μL 內(nèi)標，溶液 100 μL水－甲醇（50∶50）渦旋混勻，離心，取上清液進樣分析，記錄各組分峰面積（B）。以純水代替空白血漿，進行上述操作，進樣分析，記錄各組分峰面積（C）。基質(zhì)效應(yīng)＝A／C×100%，提取回收率＝A／B×100%。結(jié)果表明，ATO，SAX，5－OH SAX及內(nèi)標的基質(zhì)效應(yīng)為 84% ～107%，提取回收率為89% ～103%（n＝5），RSD＜11%。表明在本試驗所選擇的色譜條件下，可忽略基質(zhì)效應(yīng)影響。

穩(wěn)定性試驗：分別考察混合質(zhì)控血漿樣品在不同保存條件下的穩(wěn)定性（n＝3）。血漿樣品在室溫下放置24 h，－80℃保存60 d及反復(fù)凍融3次等處理后，按2．2項下方法操作，進樣分析。結(jié)果 ATO，SAX，5－OH SAX 的相對誤差（RE）值分別為 0．7 ～10．6，0．8 ～8．7，2．1 ～ 10．1。

2．4 藥代動力學(xué)研究

取6只SD大鼠，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，給以高脂飼料喂養(yǎng)4周，大鼠禁食、不禁飲12 h，給以鏈脲佐菌素（STZ，40 mg ／kg）腹腔注射，誘導(dǎo)糖尿病模型，選擇造模成功的大鼠模型進行實驗。T2DM大鼠同時給予SAX及ATO各10 mg／kg灌胃。分別于給藥前后0，0．25，0．5，0．75，1，1．5，2，3，4，6，8，12 h 時采血，各 0．5 mL，置EP管，血樣在 4℃下，4 000 r／min離心 15 min，取上層血漿于－80℃冰箱保存。采用UPLC－MS／MS法測定不同時間點的ATO，SAX，5－OH SAX的血藥濃度和藥－時曲線，詳見圖2。采用Win Nolin 6．1軟件按照非房室模型進行處理，計算藥代動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表2。

圖2 T2DM大鼠體內(nèi)ATO，SAX，5－OH SAX的藥－時曲線

表2 ATO，SAX，5－OH SAX在T2DM大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)± s）

表2 ATO，SAX，5－OH SAX在T2DM大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)± s）

藥代動力學(xué)參數(shù)ATO SAX 5－OH－SAX生物半衰期（t1／2，h）達峰時間（Tmax，h）峰濃度（Cmax，ng／mL）藥－時曲線下面積（AUC0－t，h·ng·mL－1）藥－時曲線下面積（AUCinf，h·ng·mL－1）平均駐留時間（MRTinf，h）4．08 ± 1．64 0．25 ± 0．00 49．17 ± 2．76 112．38 ± 20．97 1．84 ± 0．47 0．25 ± 0．00 1 155．97 ± 144．96 1 475．50 ± 337．23 1．70 ±0．55 0．65 ± 0．12 376．54 ± 21．87 700．91 ± 147．62 135．79 ± 19．621 496．09 ± 348．83707．34 ± 145．20 5．84 ± 0．852．02 ± 0．462．51 ±0．46

3 討論

T2DM患者需服用調(diào)脂藥及降糖藥，以預(yù)防心血管疾病風(fēng)險，故可同時測定ATO及SAX藥物濃度的方法對其藥代動力學(xué)研究至關(guān)重要。目前，國內(nèi)外與ATO及SAX血藥濃度測定的方法有很多，可采用RP－HPLC／UV［5］，LC － ESI－ MS，GC － MS［6］及 HPTLC － UVD［7］等方法測定血漿中ATO濃度，SAX的測定主要采用GC［8］，LC －MS ／MS［9］等方法。相對于本研究中所描述的方法，均具有檢測靈敏度不足、采集樣本量大、出峰時間長等缺點，且不能同時測定血漿樣品中ATO及SAX藥物濃度。故對其作適當(dāng)改進，增強檢測靈敏度，樣品保留時間縮短到5 min，提高了分析準確度、靈敏度及分析效率。

優(yōu)化固定相時，曾嘗試Acquity UPLC HSS T3 C18色譜柱、Waters BEH C18色譜柱及Waters shield RP C18色譜柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ATO在Acquity UPLC HSS T3 C18色譜柱無吸收峰，使用Waters BEH C18色譜柱，待測物都能檢測出，但其中5－OH SAX的響應(yīng)值過低，但這些問題在Waters shield RP C18色譜柱上均能改善，待測物具有很好的靈敏度及峰形。在流動相條件優(yōu)化時，曾采用10 mmol／L乙酸銨－乙腈為流動相，開始時嘗試等度洗脫，大水相條件下，SAX及其代謝物5－OH SAX能分開，但ATO不能很好地分離，隨著有機相比例的增加，最終在有機相為70%時，ATO被很好地分離出來。故待測物在梯度洗脫條件下，有很好的響應(yīng)值及峰形。

血漿樣品前處理對于色譜方法的建立至關(guān)重要，將直接影響待測物的可靠性及準確性。通過查閱文獻［10－11］發(fā)現(xiàn)，ATO及SAX都有采用乙腈沉淀蛋白的方法提取樣品，由于SAX極性大，而ATO極性小，因而在吹干后的復(fù)溶采用50%的甲醇。結(jié)果表明，采用乙腈蛋白質(zhì)沉淀法處理血漿樣品，待測物的基質(zhì)效應(yīng)及提取回收率均符合規(guī)定［12］。

本研究中采用UPLC－MS／MS法同時測定T2DM大鼠灌胃給藥后血漿中ATO，SAX及5－OH SAX的含量，以維格列汀為內(nèi)標，在正離子模式下檢測。結(jié)果表明，此方法具有良好的精密度與準確度，符合生物樣品分析方法要求，靈敏度和專屬性高。研究了ATO聯(lián)合SAX在T2DM大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)過程，確定了本研究中所建立的方法在非臨床藥代動力學(xué)研究中的適用性，可為其非臨床藥代動力學(xué)及毒理學(xué)等研究提供分析方法。