復(fù)方芍甘顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

邵留英 ，瞿發(fā)林 △，董文，倪玉佳，鐘 月

（1．中國(guó)人民解放軍第102醫(yī)院，江蘇 常州 213003； 2．南京中醫(yī)藥大學(xué)翰林學(xué)院，江蘇 泰州 210046）

中藥顆粒劑具有服用、攜帶、貯藏、運(yùn)輸方便等特點(diǎn)，深受廣大患者歡迎。復(fù)方芍甘顆粒的處方出自醫(yī)圣張仲景《傷寒雜病論》的芍藥甘草湯，具有益氣、養(yǎng)血、調(diào)經(jīng)、復(fù)脈的功效。芍藥甘草湯可治療抗精神病藥所致的高催乳素血癥［1－2］。我院在此湯劑基礎(chǔ)上增加炙甘草，采用現(xiàn)代制劑制成顆粒［3－4］。為控制制劑質(zhì)量，本研究中對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

高效液相色譜儀（包括CapLC2487紫外檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司）；FA1004型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；DHG9240型鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；KH2200DB型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；XS105型電子天平（梅特勒－托利多儀器有限公司）。

1．2 試藥

復(fù)方芍甘顆粒（中國(guó)人民解放軍第102醫(yī)院自制，批號(hào)分別為 201703301，201703302，201703303）；白芍對(duì)照藥材（批號(hào)為B26034－1g），甘草對(duì)照藥材（批號(hào)為B26212－1g），均由上海源葉生物科技有限公司提供；芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)為110736－201438，含量以96．4%計(jì)算），甘草酸銨對(duì)照品（批號(hào)為110731－200614），均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法

2．1 定性鑒別

白芍［5－9］：取樣品適量，研細(xì)，稱(chēng)取 0．2 g，置容量瓶中，加乙醇10 mL，30℃下超聲提取（功率為100 kHz），處理30 min，過(guò)濾，取濾液水浴蒸干，殘?jiān)?0 mL水溶解，正丁醇液提取3次，每次20 mL合并正丁醇液，用適量水洗滌，取正丁醇液蒸干，殘?jiān)? mL乙醇溶解，即得供試品溶液。取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加乙醇定容制成質(zhì)量濃度為1 g／L的溶液，即得對(duì)照品溶液。稱(chēng)取0．5 g白芍對(duì)照藥材，同法制備對(duì)照藥材溶液。按處方組成制備不含白芍的復(fù)方芍甘顆粒，稱(chēng)取0．1 g，同法制備陰性對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述溶液各2 μL，點(diǎn)樣至同一硅膠G薄層板，以三氯甲烷－甲醇－乙酸乙酯 －濃氨溶液（8∶4∶1∶1）展開(kāi)，取出，晾干，噴以 5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)清晰。對(duì)照品溶液與對(duì)照藥材溶液、供試品溶液色譜在同一 Rf值處有相同的藍(lán)紫色斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1 A。

炙甘草［10－11］：取樣品適量，研細(xì)，稱(chēng)取 0．9 g 置圓底燒瓶中，加乙醚40 mL，回流提取1 h，過(guò)濾，濾液水浴蒸干，殘?jiān)眉状?0 mL回流提取1 h，過(guò)濾，濾液水浴蒸干，殘?jiān)谜〈继崛?次，每次20 mL，合并正丁醇液，用適量水洗滌，取正丁醇液蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，即得供試品溶液。取甘草酸銨對(duì)照品適量，加甲醇定容制成質(zhì)量濃度為2 g／L的溶液，即得對(duì)照品溶液。稱(chēng)取1 g甘草對(duì)照藥材，同法制備對(duì)照藥材溶液。按處方組成制備不含炙甘草的復(fù)方芍甘顆粒，稱(chēng)取0．5 g，同法制備陰性對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述溶液各2 μL，點(diǎn)樣至同一硅膠GF254薄層板（以1%NaOH溶液制備），用乙酸乙酯 －甲酸 －水－冰醋酸（15∶2∶2∶1）展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)清晰，取出，置紫外燈（254 nm）下檢視。對(duì)照品溶液與對(duì)照藥材溶液、供試品溶液色譜在同一 Rf值處有相同顏色斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1 B。

圖1 薄層色譜圖

2．2 芍藥苷含量測(cè)定［12］

2．2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：月澤 Ze month ODS－L C18柱（150 mm×4．6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；流動(dòng)相：乙腈 －0．1%磷酸溶液（14 ∶86）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。在此色譜條件下，處方中其他成分對(duì)芍藥苷的測(cè)定無(wú)干擾，色譜圖見(jiàn)圖2。

2．2．2 溶液制備

取復(fù)方芍甘顆粒（批號(hào)為201703301）適量，研細(xì)，取細(xì)粉0．4 g，精密稱(chēng)定，置25 mL容量瓶中，加水20 mL，超聲提取（溫度為30℃，頻率為100 kHz）30 min，取出，放冷，加水定容，搖勻；精密量取5 mL，置25 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，離心 10 min，取上清液，用 0．45 μm微孔水膜過(guò)濾，取續(xù)濾液即得供試品溶液。取芍藥苷對(duì)照品，精密稱(chēng)取 12．16 mg，加水制成質(zhì)量濃度為121．6 μg／mL的對(duì)照品貯備液；精密量取對(duì)照品貯備液5 mL，加水制成質(zhì)量濃度為 60．8 μg／mL 的對(duì)照品溶液。按處方組成制備不含白芍的復(fù)方芍甘顆粒，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。

2．2．3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取芍藥苷對(duì)照品貯備液1．0，2．5，5．0，7．5，10．0 mL，分別置 10 mL 容量瓶中，用水定容，混勻，制成不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，依法進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝716 782X－20 858，r＝0．999 7（n＝7）。結(jié)果表明，芍藥苷進(jìn)樣量在0．263 2 ～2．632 0 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液適量，分別于0，4，8，12，24 h時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果的 RSD為1．50%（n＝5），表明供試品溶液在室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為201703301）6份，精密稱(chēng)定，分別制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD為0．94%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

精密度試驗(yàn)：精密量取質(zhì)量濃度為60．8 μg／mL的芍藥苷對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果的 RSD為0．34%（n＝6），表明儀器精密度良好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為201703301，芍藥苷含量為 27．51 mg／g）9 份，精密稱(chēng)定，每份 0．2 g，置 50 mL容量瓶中，精密加入質(zhì)量濃度為2．631 7 g／L的芍藥苷對(duì)照品溶液1，2，3 mL，平行操作3份，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率（n＝6）。結(jié)果見(jiàn)表1。

圖2 芍藥苷含量測(cè)定高效液相色譜圖

表1 芍藥苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

2．2．4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果批號(hào)為201703301，201703302，201703303的樣品中芍藥苷含量分別為2．45%，2．44%，2．45%，平均 2．45%。

2．3 甘草酸銨含量測(cè)定［5］

2．3．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：月澤 Ze month ODS－L C18柱（150 mm×4．6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；流動(dòng)相：乙腈 －0．017 mol／mL 磷酸溶液（35 ∶65）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。在此色譜條件下，處方中其他成分對(duì)甘草酸銨的測(cè)定無(wú)干擾，色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 甘草酸銨含量測(cè)定高效液相色譜圖

2．3．2 溶液制備

取樣品（批號(hào)為201703301）適量，研細(xì)，精密稱(chēng)取細(xì)粉0．200 3 g，分別置25 mL容量瓶中，加水20 mL，超聲提取（溫度為30℃，頻率為100 kHz），處理30 min，取出，放冷，加水定容至刻度，搖勻，離心10 min，取上清液，用0．45 μm微孔水膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取甘草酸銨對(duì)照品，精密稱(chēng)取10．75 mg，加水制成質(zhì)量濃度為210．64 μg／mL的對(duì)照品貯備液；精密量取對(duì)照品貯備液5 mL，加水制成質(zhì)量濃度為105．32 μg／mL的對(duì)照品溶液。按處方組成制備不含炙甘草的復(fù)方芍甘顆粒，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。

2．3．3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取甘草酸銨對(duì)照品貯備液1．0，2．5，5．0，7．5，10 mL，分別置 10 mL 容量瓶中，用水定容，混勻，制成不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝752 553X －760 29，r＝0．999 8（n＝5）。結(jié)果表明，甘草酸銨進(jìn)樣量在 0．421 28 ～4．212 80 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0，4，8，12，24 h時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果的 RSD為0．42%（n＝5），表明供試品溶液在室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱(chēng)定同批樣品（批號(hào)為201703301）6份，分別制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD為1．28%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

精密度試驗(yàn)：精密量取質(zhì)量濃度為105．32 μg／mL的甘草酸銨對(duì)照品溶液，按擬訂條件依法重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果的 RSD為0．85%（n＝6），表明儀器精密度良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱(chēng)取同一批樣品（批號(hào)為201703301，甘草酸銨含量為13．27 mg／g）9份，每份0．1 g，置25 mL容量瓶中，精密加入質(zhì)量濃度為0．635 g／L甘草酸銨對(duì)照品溶液1，2，3 mL，平行操作3份，依法制備供試品溶液，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

2．3．4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件分別測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果批號(hào)為201703301，201703302，201703303樣品中甘草酸銨含量分別為1．32%，1．33%，1．33%，平均 1．33%。

3 討論

3．1 定性鑒別

芍藥苷提取方法：考察2015年版《中國(guó)藥典（一部）》白芍中芍藥苷的提取方法，但雜質(zhì)多、分離效果差。改用水飽和正丁醇液提取，正丁醇飽和水液洗滌［8］，結(jié)果雜質(zhì)少、分離效果好、斑點(diǎn)清晰。

芍藥苷展開(kāi)劑：以三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－甲酸（40 ∶5 ∶10 ∶0．2）［9］為展開(kāi)劑，陰性有干擾；以乙酸乙酯 － 甲酸 －乙酸 － 水（15 ∶2 ∶1 ∶2）［10］為展開(kāi)劑，陰性無(wú)干擾，但展開(kāi)效果不好；最終確定三氯甲烷－甲醇－乙酸乙酯 －濃氨溶液（8 ∶4 ∶1 ∶1）［12］展開(kāi)的效果最好，Rf值為 0．4，陰性無(wú)干擾。

表2 甘草酸銨加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

芍藥苷點(diǎn)樣量、展開(kāi)溫度：考察供試品溶液、對(duì)照品溶液和對(duì)照藥材溶液點(diǎn)樣量1，2，3 μL，以展開(kāi)劑展開(kāi)、顯色劑顯色、檢視，結(jié)果表明，點(diǎn)樣量均為2 μL時(shí)斑點(diǎn)圓整、清晰；取供試品溶液、對(duì)照品溶液和對(duì)照藥材溶液點(diǎn)于同一硅膠G板上，以展開(kāi)劑分別在6，20，35℃展開(kāi)、顯色劑顯色、檢視。結(jié)果表明，在20℃時(shí)，溶液分離效果最佳。故選擇點(diǎn)樣量均為2 μL，溫度為20℃的條件展開(kāi)。

甘草酸銨薄層板：曾在硅膠G薄層板上點(diǎn)樣，結(jié)果展開(kāi)效果差、斑點(diǎn)不清晰；改在硅膠GF254薄層板上點(diǎn)樣，結(jié)果展開(kāi)效果好、斑點(diǎn)清晰。

甘草酸銨展開(kāi)劑：以乙酸乙酯、甲酸、冰醋酸、水（15 ∶1 ∶1 ∶2）［13］展開(kāi)，Rf值偏小，故調(diào)整比例，以乙酸乙酯、甲酸、水、冰醋酸（15 ∶2 ∶2 ∶1）展開(kāi)，陰性無(wú)干擾，分離效果好。

甘草酸銨點(diǎn)樣量、展開(kāi)溫度：考察供試品溶液、對(duì)照品溶液和對(duì)照藥材溶液點(diǎn)樣量 1，2，3 μL，以展開(kāi)劑展開(kāi)、顯色劑顯色、檢視，結(jié)果表明，點(diǎn)樣量均為2 μL時(shí)斑點(diǎn)清晰，易于辨識(shí)；取供試品溶液、對(duì)照品溶液和對(duì)照藥材溶液點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以展開(kāi)劑分別在6，20，35℃展開(kāi)，顯色劑顯色，檢視，結(jié)果表明，在20℃時(shí)，溶液的展開(kāi)效果好，Rf值適當(dāng)。故選擇點(diǎn)樣量均為2 μL、溫度為20℃的展開(kāi)條件。

3．2 含量測(cè)定

提取溶劑與方法：根據(jù)芍藥苷、甘草酸銨的理化特性，選用了甲醇、乙醇、70%乙醇、水為提取溶劑，超聲提取，以水提取效率最高，峰形對(duì)稱(chēng)，雜質(zhì)對(duì)主峰無(wú)干擾，故本試驗(yàn)中選擇水為提取溶劑。再對(duì)水超聲提取和回流提取的提取效率進(jìn)行考察，結(jié)果顯示，兩種提取方式效率無(wú)明顯差異，且超聲提取操作簡(jiǎn)單，最終選擇超聲提取。

提取溫度與時(shí)間：考察了提取溫度、提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響，結(jié)果顯示，提取溫度超過(guò)30℃，提取效率無(wú)明顯增加；而提取時(shí)間超過(guò)30 min，提取效率變化亦不明顯，故選擇溫度為30℃、超聲30 min提取。

流動(dòng)相及檢測(cè)波長(zhǎng)：曾參考文獻(xiàn)［3］采用乙腈－0．017 mol／L 磷酸水溶液 －三乙胺（35 ∶65 ∶0．3）作流動(dòng)相測(cè)定甘草酸銨（實(shí)際測(cè)得峰是甘草酸的峰，再按系數(shù)折算成甘草酸銨，即甘草酸銨的量＝甘草酸的量×1．020 7），結(jié)果未出峰，原因是流動(dòng)相偏堿性，甘草酸銨無(wú)法水解成甘草酸，故最終選擇乙腈－0．017 mol／L磷酸水溶液（35∶65）為流動(dòng)相。本試驗(yàn)中選擇230 nm為芍藥苷檢測(cè)波長(zhǎng)，250 nm為甘草酸銨檢測(cè)波長(zhǎng)，兩主峰附近均無(wú)雜質(zhì)峰干擾，且在這兩波長(zhǎng)下靈敏度更高、峰形更佳。

加樣回收試驗(yàn)：復(fù)方芍甘顆粒為中藥制劑，故加樣回收試驗(yàn)中高、中、低濃度對(duì)照品加入量為所測(cè)供試品成分量的 1．5，1，0．5 倍，各平行測(cè)定 3 份，結(jié)果更科學(xué)、可信。