丹郁消癖顆粒質(zhì)量控制方法研究*

蒙麥俠，陳 萍 ，趙治國 ，陳志永，楊智峰

（1．陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003； 2．陜西省西安市碑林區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710002）

丹郁消癖顆粒處方來源于陜西省碑林區(qū)中醫(yī)醫(yī)院乳腺重點專科，為臨床治療乳腺增生病的經(jīng)驗方，由丹參、益母草、青皮、皂角刺、赤芍、當歸、川楝子、柴胡和夏枯草組方，全方發(fā)揮疏肝理氣、活血化瘀及軟堅散結(jié)的作用，對肝郁氣滯、痰瘀互結(jié)型乳腺增生有良好療效。該藥一直以湯劑形式應(yīng)用，湯劑為傳統(tǒng)劑型，具有不易保存、攜帶不便、服用量大等不足，考慮乳腺增生病用藥周期長的特點，為提高患者用藥依從性，陜西省碑林區(qū)中醫(yī)醫(yī)院聯(lián)合陜西省中醫(yī)藥研究院將其研究開發(fā)為顆粒劑。方中丹參為君藥，益母草、赤芍、當歸為臣藥，青皮、皂角刺、夏枯草、川楝子為佐藥，柴胡為使藥。本研究中建立了益母草、赤芍、青皮、夏枯草、柴胡和皂角刺的薄層色譜鑒別方法，以及有效成分丹參素鈉的含量測定方法，并確定含量限度，從而為丹郁消癖顆粒的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

LC－2010A HT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；UV－ⅥA型透射反射儀（北京智源通生物技術(shù)研究所）；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BT 25S 型電子分析天平（d＝0．01 mg，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）。

1．2 試藥

丹參素鈉對照品（批號為110855－201412），對照藥材柴胡（批號為 120992－201108）、青皮（批號為121155－200502）、赤芍（批號為 121093－201303）、益母草（批號為 0912－9905）、夏枯草（批號為 120993－201105）、皂角刺（批號為 1121210 －201003），均來源于中國藥品生物制品檢定所；丹郁消癖顆粒樣品（規(guī)格為每袋 15 g，批號分別為 170810，170815，170820），由西安市碑林區(qū)中醫(yī)醫(yī)院提供；甲醇為色譜純，水為超純水，無水乙醇、正丁醇和乙酸乙酯等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 薄層色譜鑒別

2．1．1 溶液制備

供試品溶液：取本品內(nèi)容物3份，每份10 g。第1份加50 mL無水乙醇，超聲提取30 min，濾過，濾液水浴濃縮至2 mL，作為益母草、赤芍、青皮和夏枯草的供試品溶液［1］158；第 2 份加 50 mL 蒸餾水，加熱使溶解，用水飽和正丁醇萃取2次，每次25 mL，合并萃取液，加等體積氨試液，搖勻，放置，分取上層液，水浴蒸干，殘渣加2 mL甲醇使溶解，作為柴胡的供試品溶液；第3份加50 mL甲醇，超聲提取30 min，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加20 mL水使溶解，用乙酸乙酯萃取3次，每次20 mL，合并萃取液，蒸干，殘渣加20 mL甲醇使溶解，作為皂角刺的供試品溶液。

陰性對照品溶液：按組方比例，分別去除益母草、赤芍、青皮、夏枯草和柴胡后的原處方藥材，按樣品制備工藝，制成缺上述5種藥材的陰性樣品；去除皂角刺和川楝子后，制成缺皂角刺和川楝子的雙陰性樣品。取缺益母草、赤芍、青皮、夏枯草和柴胡的陰性樣品，缺皂角刺和川楝子雙陰性樣品各10 g，按供試品溶液制備方法處理，制成上述相應(yīng)陰性對照品溶液。

對照藥材溶液：取益母草對照藥材1 g，赤芍對照藥材 0．5 g，青皮對照藥材 0．3 g，夏枯草對照藥材 2．5 g，按供試品溶液制備方法處理，分別制成上述4種對照藥材溶液；取柴胡對照藥材0．5 g，加20 mL甲醇，回流提取30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加20 mL水使溶解，用水飽和正丁醇萃取2次，下同柴胡供試品溶液制備方法處理，制成柴胡對照藥材溶液；取皂角刺對照藥材1 g，加50 mL水，加熱回流2 h，濾過，濾液加乙酸乙酯萃取3次，每次15 mL，合并萃取液，蒸干，殘渣加2 mL甲醇使溶解，制成皂角刺對照藥材溶液。

2．1．2 方法與結(jié)果

益母草：按2015年版《中國藥典（四部）》0502薄層色譜法進行鑒別。吸取2．1．1項下益母草供試品溶液、對照藥材溶液和陰性對照品溶液各5 μL，依次點于同一硅膠G薄層板上，以無水乙醇－丙酮－鹽酸（6∶10∶1）為展開劑，上行展開，取出晾干，在105℃加熱15 min后，放至室溫，噴以三氯化鐵試液與稀碘化鉍鉀試液（1∶10）的混合溶液至色譜斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上有相同橙色斑點出現(xiàn)，陰性無干擾。色譜圖見圖1 A。

赤芍：按2015年版《中國藥典（四部）》0502薄層色譜法進行鑒別。吸取2．1．1項下赤芍供試品溶液、對照藥材溶液和陰性對照品溶液各2～4 μL，依次點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－甲酸（40 ∶5 ∶15 ∶0．2）為展開劑，上行展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸乙醇溶液（需臨用現(xiàn)配），75℃加熱至色譜斑點顯色清晰［1］290。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同的藍色斑點，陰性無干擾。色譜圖見圖1 B。

青皮：按2015年版《中國藥典（四部）》0502薄層色譜法進行鑒別。吸取2．1．1項下青皮供試品溶液、對照藥材溶液和陰性對照品溶液各3 μL，依次點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯－乙酸乙酯 －甲醇（9∶4∶1）為展開劑，上行展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，置紫外光燈（365 nm）下檢視［2－3］。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點，陰性無干擾。色譜圖見圖1 C。

夏枯草：按2015年版《中國藥典（四部）》0502薄層色譜法進行鑒別。吸取2．1．1項下夏枯草供試品溶液、對照藥材溶液和陰性對照品溶液各5 μL，依次點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷－乙酸乙酯－甲酸（15 ∶1．5 ∶0．5）為展開劑，上行展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視［4－6］。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色熒光斑點，陰性無干擾。色譜圖見圖1 D。

柴胡：按2015年版《中國藥典（四部）》0502薄層色譜法進行鑒別。吸取2．1．1項下柴胡供試品溶液、對照藥材溶液和陰性對照品溶液各2～3 μL，依次點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水（30∶10∶1）為展開劑，上行展開，取出，晾干，噴以2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，60℃加熱至色譜斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視［7－9］。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同黃色熒光斑點，且久置后熒光更加明顯，陰性無干擾。色譜圖見圖1 E。

皂角刺：按2015年版《中國藥典（四部）》0502薄層色譜法進行鑒別。吸取2．1．1項下皂角刺供試品溶液、對照藥材溶液和缺皂角刺和川楝子的雙陰性對照品溶液各5 μL，依次點于同一硅膠G薄層板上，以甲醇－三氯甲烷 －濃氨試液（1 ∶9 ∶0．2）為展開劑，上行展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視［10］。供試品溶液在與對照藥材溶液相應(yīng)位置上有相同亮藍色熒光斑點，陰性無干擾。色譜圖見圖1 F。

2．2 含量測定［11－13］

2．2．1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Inertsil ODS－3柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 －0．5% 冰醋酸溶液（7∶93）；檢測波長：280 nm；流速：1．0 mL ／min；柱溫：35 ℃。理論板數(shù)按丹參素鈉峰計不低于3 000。

2．2．2 溶液制備

對照品溶液：取丹參素鈉對照品適量，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，制成每1 mL含0．375 mg的貯備液；取貯備液6 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成1 mL含0．225 mg的對照品溶液。

圖1 薄層色譜圖

供試品溶液：取本品內(nèi)容物2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放至室溫，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，用0．45 μm微孔濾膜濾過，即得。

陰性對照品溶液：按組方比例，去除丹參后的原處方藥材，按樣品制備工藝制得缺丹參的陰性樣品；取陰性樣品2 g，按供試品溶液制備方法處理，即得缺丹參陰性對照品溶液。

2．2．3 提取完全性試驗

取同一批（批號為170810）樣品內(nèi)容物5份，每份約2 g，精密稱定，置磨口錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，第 1 ～4 份依次超聲提取 10，20，30，40 min，第5份回流提取30 min，分別提取后，放至室溫，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液用0．45 μm微孔濾膜濾過，得供試品溶液，按擬訂色譜條件測定丹參素鈉含量。結(jié)果回流提取30 min，丹參素鈉提取率最高，故確定提取方式為回流提取30 min。結(jié)果見表1。

表1 提取完全性試驗結(jié)果

2．2．4 方法學(xué)考察

專屬性試驗：分別精密吸取2．2．2項下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液色譜中，丹參素鈉色譜峰與其他相鄰峰均能達到基線分離；陰性對照品溶液色譜圖中，丹參素鈉色譜峰保留位置無干擾峰出現(xiàn)。結(jié)果見圖2。

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2．2．2項下質(zhì)量濃度為 0．225 g ／L 的對照品溶液 4，6，8，10，15，20 μL，注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件測定峰面積，以丹參素鈉含量（X）與其峰面積（Y）進行線性回歸，得丹參素鈉回歸方程 Y＝611 919X＋44 903，r＝0．999 9（n＝6）。結(jié)果表明，丹參素鈉進樣量在0．9～4．5 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖2 高效液相色譜圖

精密度試驗：精密吸取2．2．2項下對照品溶液和供試品溶液各10 μL，連續(xù)進樣6次，按擬訂色譜條件測定峰面積。結(jié)果的 RSD分別為1．80%和1．50%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：精密吸取2．2．2項下同一供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件測定峰面積，每隔2 h測定1次，共測定6次，考察12 h內(nèi)峰面積變化。結(jié)果的 RSD為2．10%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取同一批（批號為170810）樣品內(nèi)容物6份，每份約2 g，精密稱定，按2．2．2項下方法處理樣品，得6份供試品溶液，按擬訂色譜條件測定丹參素鈉含量。結(jié)果的 RSD為1．94%（n＝6），表明方法重復(fù)性好。

加樣回收試驗：取同一批（批號為170810）已知含量的樣品約1 g，共6份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入質(zhì)量濃度為0．180 2 g／L的丹參素鈉對照品溶液10 mL，再精密加入甲醇15 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放至室溫，用甲醇補足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，用0．45 μm的微孔濾膜濾過，得供試品溶液，按擬訂色譜條件測定丹參素鈉含量。結(jié)果見表2。

表2 丹參素鈉加樣回收試驗結(jié)果（n＝6）

2．2．5 樣品含量測定

分別取3批樣品生產(chǎn)中所用丹參原藥材、中間品和成品各2 g，精密稱定，按2．2．2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定，計算丹參素鈉含量，得成品中丹參素鈉平均轉(zhuǎn)移率為205．8%，平均含量為2．11 mg／g。詳見表3。

表3 3批樣品丹參素鈉含量測定結(jié)果

3 討論

在薄層鑒別研究中，益母草所用顯色劑需臨用現(xiàn)配，且在配置過程中堿式硝酸鉍難溶于冰醋酸，需放置24 h后方可全部溶解；青皮鑒別時，先采用藥典方法，展開耗時長，且效果不理想，后建立了用對照藥材，以甲苯－乙酸乙酯－甲醇（9∶4∶1）為展開劑，10%的硫酸乙醇溶液顯色，在紫外光燈（365 nm）下檢視，效果較理想；皂角刺鑒別時，缺皂角刺的陰性樣品對檢出有干擾，為了排除干擾，對處方中柴胡、川楝子、丹參等其余藥材按皂角刺對照藥材處理方法處理并進行薄層展開，結(jié)果川楝子對皂角刺檢出有干擾，經(jīng)制備川楝子和皂角刺雙陰性樣品后，再行薄層展開，無干擾；皂角刺消腫托毒、川楝子行氣止痛，兩者同時用在治療乳腺增生的處方中概率較大，上述研究為其他相關(guān)藥物標準制訂提供了借鑒。

丹參為丹郁消癖顆粒處方君藥，味苦，性微寒，歸心、肝經(jīng)，具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩之功；丹參所含丹參素鈉具有擴張冠狀動脈，抗血小板凝集、動脈粥樣硬化、血栓形成，促進血管新生等作用［14］，對于改善乳腺增生瘀血癥狀發(fā)揮重要療效，本研究中選擇丹參素鈉作為丹郁消癖顆粒的定量指標，對其質(zhì)量控制具有重要意義。在測定丹參素鈉含量時選用了Agela和Inertsil ODS－3兩種型號色譜柱，后者峰形和分離效果較好，故選用ODS－3色譜柱。

由含量測定結(jié)果可見，丹參素鈉提取轉(zhuǎn)移率增高，可能是提取過程中益母草或其他藥材生物堿成分的存在使其溶解度增加，或加工過程中煎煮濃縮高溫環(huán)境使丹參中酚酸類成分受熱分解所致。

本研究中建立了益母草、赤芍、青皮、皂角刺、夏枯草和柴胡的薄層色譜鑒別方法，建立了君藥丹參中丹參素鈉的含量測定方法，并考慮到藥材的產(chǎn)地、批次之間的差異性，確定丹參素鈉含量限度為丹郁消癖顆粒含丹參以丹參素鈉計不低于1．60 mg／g。