高效液相色譜－示差折光檢測(cè)器法測(cè)定牛磺酸顆粒和滴眼液中牛磺酸含量

仵淑紅，王麗霞

（北京市東城區(qū)食品藥品安全監(jiān)控中心，北京 100050）

牛磺酸（taurine）廣泛分布于人體內(nèi)各組織、器官，是人體生長(zhǎng)、發(fā)育必需的氨基酸。牛磺酸對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、視覺發(fā)育系統(tǒng)有重要作用，還具有增強(qiáng)心肌收縮力、抗心律失常、鈣流動(dòng)調(diào)控、促進(jìn)膽汁分泌、解毒、提高機(jī)體免疫等生物學(xué)功能［1］。牛磺酸顆粒作為解熱鎮(zhèn)痛藥，可緩解感冒初期的發(fā)熱，適用于感冒、扁桃體炎、支氣管炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。牛磺酸滴眼液用于牛磺酸代謝失調(diào)引起的白內(nèi)障治療，也可用于急性結(jié)膜炎、皰疹性結(jié)膜炎、病毒性結(jié)膜炎的輔助治療。由于牛磺酸的紫外吸收較弱，2015 年版《中國(guó)藥典（二部）》［2］對(duì)牛磺酸片劑、膠囊劑和散劑采用中和滴定方法測(cè)牛磺酸含量，方法衍生步驟比較煩瑣，同時(shí)要求在反應(yīng)管中進(jìn)行，對(duì)儀器的配置要求較高。其他測(cè)定方法還有高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測(cè)法［3］、自動(dòng)電位滴定法［4］、分光光度法［5］、質(zhì)譜法［6］等。國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)［7］采用苯乙烯共聚體與磺基（Ca－配位）結(jié)合的凝膠為填充劑，內(nèi)消旋肌醇為內(nèi)標(biāo)物的高效液相色譜－示差折光檢測(cè)器法可對(duì)復(fù)方牛磺酸滴眼液中牛磺酸成分進(jìn)行分析。本研究中采用示差折光檢測(cè)器，NH2柱為分析柱，建立了牛磺酸顆粒和牛磺酸滴眼液中牛磺酸含量的高效液相色譜分析方法。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

儀器：Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀，Agilent 1260示差折光檢測(cè)器（1260－RID）；XP205型電子天平（梅特勒－托利多）；Satorius 611DI純化水系統(tǒng)；FB15065型超聲波清洗器（Fisher Scientific）。

試藥：牛磺酸對(duì)照品（批號(hào)為111616－201605，含量為 100．0% ），丙氨酸對(duì)照品（批號(hào)為 140680－200803，含量為99．9%），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；牛磺酸顆粒（A廠，批號(hào)為160601；B廠，批號(hào)為20160522；C廠，批號(hào)為 151108），規(guī)格均為每袋0．4 g；牛磺酸滴眼液（A 廠，批號(hào)為 16011501，規(guī)格為每支 0．4 g∶8 mL）；牛磺酸滴眼液（B廠，批號(hào)為161204，規(guī)格為每支0．5 g∶10 mL）；牛磺酸滴眼液（C廠，批號(hào)為 161001，規(guī)格為0．5 g ∶10 mL）；乙腈為 Fisher Chemical色譜純，試驗(yàn)用水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2．1 溶液制備

取牛磺酸對(duì)照品適量，精密稱定，置容量瓶中，加流動(dòng)相溶解，制成質(zhì)量濃度為1．6 g／L的牛磺酸對(duì)照品貯備液；精密量取5 mL，置20 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度為0．4 g／L的對(duì)照品溶液。

取牛磺酸顆粒細(xì)粉適量（相當(dāng)于牛磺酸100 mg），精密稱定，置50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，制成質(zhì)量濃度為2 g／L的牛磺酸顆粒供試品貯備液；精密量取續(xù)濾液5 mL，置25 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為0．4 g／L的牛磺酸顆粒供試品溶液A。精密量取牛磺酸滴眼液2 mL（相當(dāng)于牛磺酸100 mg），置50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，制成質(zhì)量濃度為2 g／L的牛磺酸滴眼液貯備液；精密量取續(xù)濾液5 mL，置25 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為0．4g／L的供試品溶液B。取流動(dòng)相，即得空白溶液。

取牛磺酸和丙氨酸對(duì)照品各約10 mg，精密稱取，置25 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液。

2．2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Waters NH2柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：水 －乙腈（40 ∶60）；流速：0．8 mL ／min；柱溫：35．0 ℃；參比池溫度：35．0 ℃；檢測(cè)池溫度：35．0 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。分別取 2．1 項(xiàng)下 5 種溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，牛磺酸保留時(shí)間為6．217 min，丙氨酸保留時(shí)間為 6．873 min，丙氨酸與牛磺酸完全分離，分離度為2．66，牛磺酸峰理論板數(shù)為11 614。在供試品溶液A色譜圖中，牛磺酸保留時(shí)間為 6．273 min，5．601 min 處出現(xiàn)一峰，兩峰分離度為3．03，該峰對(duì)牛磺酸的測(cè)定無干擾；供試品溶液B色譜圖中，除溶劑外未發(fā)現(xiàn)干擾峰。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2．3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取牛磺酸對(duì)照品約50 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻；分別精密量取 5．00，4．00，3．00，2．00，1．00，0．50，0．25 mL，置 10 mL 容量瓶中，制成質(zhì)量濃度為 1．00，0．80，0．60，0．40，0．20，0．10，0．05 g ／L 的牛磺酸對(duì)照品溶液。按擬訂色譜條件，進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝195 768．56X ＋1 085．93，r＝0．998 58（n ＝7）。結(jié)果表明，牛磺酸質(zhì)量濃度在 0．05 ～1．00 g／L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：分別取線性關(guān)系考察項(xiàng)下質(zhì)量濃度為1．00，0．40，0．05 g／L 的對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣 20 μL，結(jié)果的 RSD 分別為 0．31% ，0．37% ，0．36%（n＝5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取質(zhì)量濃度為0．4 g／L的對(duì)照品溶液，室溫放置，按擬訂色譜條件分別在制備后0，1，2，4，6，20，24 h 時(shí)進(jìn)樣 20 μL。結(jié)果的 RSD 為 0．28%（n ＝7），表明對(duì)照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表1 牛磺酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

檢測(cè)限確定：取質(zhì)量濃度為0．4 g／L的牛磺酸對(duì)照品溶液，逐步稀釋，按擬訂色譜條件進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖。結(jié)果信噪比為 3 ／1 時(shí)，檢測(cè)限為 0．5 μg ／mL。

加樣回收試驗(yàn)：分別精密量取2．1項(xiàng)下牛磺酸顆粒供試品貯備液 1．6，2．0，2．4 mL，共 9 份，分別置 10 mL容量瓶中，分別加入牛磺酸對(duì)照品貯備液 2．0，2．5，3．0 mL，加流動(dòng)相稀釋至刻度，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。精密量取2．1項(xiàng)下牛磺酸滴眼液供試品貯備液2 mL，共9份，分別置10 mL容量瓶中，以80%，100%，120%3個(gè)水平濃度精密加入牛磺酸對(duì)照品貯備液2．0，2．5，3．0 mL，加流動(dòng)相稀釋至刻度，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

2．4 樣品含量測(cè)定

取3批牛磺酸顆粒、牛磺酸滴眼液和牛磺酸對(duì)照品適量，精密稱定，依法制備供試品溶液和對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果3批牛磺酸顆粒樣品（批號(hào)分別為160601，20160522，151108）的牛磺酸含量分別為98．33%，103．42%，100．54%；3批牛磺酸滴眼液樣品（批號(hào)分別為 16011501，161204，161001）的牛磺酸含量分別為93．67%，96．65%，99．08% 。

3 討論

牛磺酸化學(xué)結(jié)構(gòu)式H2N—CH2—CH2—SO3H，相對(duì)分子量為125．15，易溶于水，不溶于無水乙醇、乙醚和丙酮。由于牛磺酸分子量相對(duì)較小，無苯基類疏水集團(tuán)，在藥物分析常用的十八烷基硅膠柱上的保留能力較弱，試驗(yàn)初期采用C18柱，水－乙腈不同比例分析，其保留時(shí)間比較短。分子中具有極性氨基、磺基親水基團(tuán)，在水和乙腈體系流動(dòng)相中，能與氨基柱的氨基基團(tuán)達(dá)到保留，增大流動(dòng)相中乙腈的比例，牛磺酸的保留時(shí)間增加，水－乙腈（40∶60）流動(dòng)相條件下，氨基柱對(duì)牛磺酸的保留時(shí)間達(dá)到6 min，理論板數(shù)達(dá)11 614，分離效果良好。由于牛磺酸溶解能力限制，繼續(xù)增加流動(dòng)相中乙腈比例至水－乙腈（30∶70），牛磺酸不能充分溶解，因此選擇水－乙腈（40∶60）為流動(dòng)相，氨基柱為分析柱。

2015 年版《中國(guó)藥典》［2］、美國(guó)藥典 USP35 －NF30［8］和日本藥典JP17［9］，未收載明確的牛磺酸雜質(zhì)。參考2015 年版《中國(guó)藥典》［2］和文獻(xiàn)［10］，選擇丙氨酸和牛磺酸作為系統(tǒng)適用性溶液考察方法的專屬性，分離度良好。專屬性試驗(yàn)表明，在牛磺酸色譜峰處無干擾峰。加樣回收試驗(yàn)結(jié)果表明，回收率滿足要求。