靶向干擾Livin對HEC-1-A細胞侵襲遷移能力的影響*

王曉華，張玉娟

(承德醫學院附屬醫院婦科，河北承德 067000)

子宮內膜癌發病率逐年上升，早期患者經外科手術治療預后較好，但晚期患者的中位生存時間不超過1年[1]，侵襲轉移是影響晚期腫瘤患者生存率的重要因素。Livin基因是凋亡蛋白抑制因子(IAPs)家族中的一員，目前對Livin的研究主要集中在其抗細胞凋亡方面，而對子宮內膜癌細胞侵襲及遷移能力的影響目前鮮有報道。本研究應用RNA干擾技術特異性下調Livin基因表達水平，觀察Livin對人子宮內膜癌細胞株(HEC-1-A)細胞侵襲及遷移能力的調控作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 HEC-1-A細胞株購自廣州吉妮歐公司。

1.1.2小分子干擾RNA 特異性小分子干擾RNA(Livin-siRNA)和陰性對照序列(Livin-NC)由蘇州吉瑪公司設計合成。

1.1.3主要試劑 Lipofectamine 2000、SYBR Green qPCR SuperMIX-UDG購自美國Invitrogen公司；Trizol 購自美國Ambion公司；Takara RNA PCR TM KIT(AMV)Ver.3.0購自日本TaKaRa公司；Livin、β-actin兔多克隆抗體購自英國Abcam公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel matrix Basement membrane購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1細胞轉染 在轉染前24 h將細胞以1×105/mL密度接種在6孔板中，使轉染期間細胞豐度為30%～50%。根據Lipofectamine 2000說明進行轉染試劑的制備。試驗分為Livin-si組(轉染Livin-siRNA干擾序列)、Livin-NC組(轉染Livin-NC陰性對照序列)和Livin-B組(正常培養的HEC-1-A細胞)。轉染6 h后棄去原培養基，更換為含10%胎牛血清(FBS)培養基繼續培養。

1.2.2qRT-PCR檢測Livin mRNA表達 轉染后48 h，用預冷卻的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌6孔板中的細胞2次，Trizol法提取細胞總RNA。由大連寶生物公司設計合成目的基因Livin及內參基因GAPDH的引物序列(表1)。根據Takara RNA PCR TM KIT(AMV)Ver.3.0說明書逆轉錄合成cDNA第1條鏈，應用SYBR Green qPCR SuperMIX-UDG 試劑盒進行qRT-PCR反應。反應條件：95 ℃ 3 min共1循環，95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共40循環，然后95 ℃ 1 min、60 ℃ 30 s、95 ℃ 30 s進行熔解曲線分析。應用2-△△ct方法計算目的基因相對表達量。

表1 Livin和GAPDH引物序列

1.2.3Western blot檢測Livin蛋白表達 轉染后48 h收集各組細胞，將蛋白裂解液加入細胞沉淀中并在冰浴中孵育30 min。BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白含量后，取50 μg進行凝膠電泳，分離蛋白并電轉到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，二抗(1∶3 000)孵育1 h。電化學發光(ECL)超敏化學發光液顯影，Tanon 6100化學發光圖像分析系統進行成像分析，目的蛋白Livin與內參蛋白β-actin的光密度比值計算Livin的相對表達量。

1.2.4Transwell小室侵襲及遷移試驗 使用Coring的小室模型，Matrigel基質膠1∶5稀釋后每個小室100 μL均勻包被小室基底膜。收集轉染48 h后各組細胞，加入DMEM培養基制備單細胞懸液，調整細胞密度至4×105/mL，上室加入100 μL細胞懸液，下室加入600 μL 含20%FBS培養基。培養36 h甲醇固定，結晶紫染色，樹膠封片。顯微鏡下觀察6個視野細胞數量計數取平均值，每組3個小室。遷移試驗不用包被Matrigel基質膠，培養箱孵育時間為26 h，其余同細胞侵襲試驗。

2 結 果

2.1qRT-PCR檢測轉染后Livin mRNA表達情況 Livin-si組與Livin-NC組、Livin-B組比較，Livin mRNA相對表達量明顯減少，差異有統計學意義(F=95.976,P=0.007)；Livin-NC組與Livin-B組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1。

圖1 轉染后3組細胞Livin mRNA比較

2.2Western blot檢測轉染后Livin蛋白表達情況 Livin-si組比較Livin-NC組、Livin-B組，Livin蛋白相對表達量明顯較少，差異有統計學意義(F=603.705,P=0.002)；Livin-NC組與Livin-B組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2、3。

A：Livin-si組；B：Livin-NC組；C：Livin-B組

圖2 3組細胞Western blot蛋白條帶

圖3 轉染后3組細胞Livin蛋白表達比較

2.3干擾Livin表達后細胞侵襲及遷移能力變化 Transwell小室侵襲試驗中，Livin-si組與Livin-NC組、Livin-B組比較，穿膜細胞數明顯減少，差異有統計學意義(F=41.026,P=0.001)。遷移試驗中，與Livin-NC組和Livin-B組相比，Livin-si組穿膜細胞數同樣明顯減少，差異有統計學意義(F=42.058,P<0.01)，見圖4～6。

A:Livin-si組；B：Livin-NC組

圖4干擾Livin表達后細胞侵襲能力變化(結晶紫染色，×200)

A:Livin-si組；B：Livin-NC組

圖5干擾Livin表達后細胞遷移能力變化(結晶紫染色，×200)

圖6 干擾Livin表達后3組穿膜細胞數比較

3 討 論

子宮內膜癌發病率逐年上升且呈低齡化趨勢發展，尤其是Ⅱ型內膜癌因其更具有早期侵襲轉移的傾向，臨床預后更差，控制其浸潤和轉移則成為臨床治療中亟待解決的問題[2-3]。目前對于惡性腫瘤的治療方法，除了手術和放化療外，基因靶向治療為惡性腫瘤的治療提供了新的方向[4]。基因靶向治療的策略是通過制備正常基因代替存在遺傳缺陷的基因，或關閉、抑制異常基因的表達。

Livin是IAPs家族的成員，編碼Livin的桿狀病毒IAP重復序列7(BIRC7)基因位于人類染色體20q13.3上，長度為46 kb，包含7個外顯子和6個內含子。 研究表明Livin在淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、乳腺癌、胃腸腫瘤、肝癌、肺癌、宮頸癌等一些腫瘤組織中特異性高表達[5-11]。孫炯等[12-14]研究發現Livin在子宮內膜癌中存在異常高表達，并且與子宮內膜癌的分期、病理分級、淋巴結轉移顯著相關。大量的研究報道主要是針對Livin基因促進腫瘤細胞增殖、抑制其凋亡的作用。然而，最近的研究表明Livin不僅參與了腫瘤細胞的抗凋亡機制，同時還在腫瘤細胞的侵襲及轉移過程中發揮作用[15-16]。LIU等[17]研究表明，Livin可以促進肝癌 HepG2細胞的侵襲及轉移能力。ZHAO等[18]研究發現，Livin在胃癌BGC832 細胞的侵襲轉移中發揮了重要作用，干擾Livin表達可明顯抑制BGC832 細胞的侵襲轉移能力。

本課題選擇生物學行為更具侵襲性的HEC-1-A細胞(中低分化腺癌)作為研究對象，構建Livin的小分子干擾RNA，轉染細胞后，qRT-PCR和Western blot分析評估Livin mRNA和蛋白質的表達水平。研究結果表明，用Livin-siRNA轉染的HEC-1-A細胞Livin表達水平下調，表明所選靶序列的有效性。抑制Livin表達后，HEC-1-A細胞的侵襲和遷移能力明顯減弱。CHEN等[19]研究顯示，在前列腺癌PC-3、DU-145細胞系中，Livin是通過NF-κB信號通路調節大分子糖蛋白FN，進而調節前列腺癌細胞的侵襲能力。但Livin調節HEC-1-A細胞侵襲及遷移能力的具體分子機制目前尚不明確，是否也通過上述信號通路調節尚需進一步研究證實。

綜上所述，Livin在子宮內膜癌的侵襲及轉移中發揮了一定的作用，干擾Livin表達可以為子宮內膜癌的靶向治療提供一定的理論依據。