間質性肺疾病患者外周血雙陰性T淋巴細胞的變化及意義*

張平驥，謝 通，戴 麗，李天水，夏國光，張運劍，王 卓

(北京積水潭醫院呼吸科 100035)

間質性肺疾病是以彌漫性肺泡單位慢性炎癥和間質纖維化為主要病理特征的一大組疾病[1]。其中彌漫性肺泡慢性炎癥在間質性肺疾病的發生、發展中起到重要作用。外周血雙陰性T淋巴細胞(double-negative T-cell，DNT)是免疫調節T淋巴細胞的一種，其表面既不表達CD4也不表達CD8抗原。DNT的免疫功能較為復雜，一方面可通過細胞介導的細胞毒作用抑制效應T細胞的功能從而發揮免疫抑制作用，另一方面可分泌多種促進炎癥的細胞因子，參與機體多種炎性反應過程。DNT與感染、腫瘤、結締組織病等密切相關，成為近期研究熱點，但其在間質性肺疾病中的作用并不明確。本研究選取間質性肺疾病患者及健康對照者作為研究對象，將其分為特發性肺間質纖維化、結締組織病相關性間質性肺疾病和其他類型3組，采集其外周血并通過流式細胞術進行DNT計數，比較不同組間DNT表達水平以探究DNT與間質性肺疾病的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2015年4月至2017年11月就診于本院完善肺部CT并確診為間質性肺疾病的86例患者作為病例組，其中結締組織病相關性間質性肺疾病37例、特發性肺間質纖維化36例和其他類型肺間質纖維化13例(硒肺3例，淋巴管滑肌瘤病1例，IPAF 5例，不明原因的4例)。病例組中男43例，女43例，平均年齡(69.48±10.29)歲。選取45例同期健康體檢者作為對照組，其中男20例，女25例，平均年齡(54.44±16.68)歲。排除標準：重癥感染、腫瘤、結核等其他疾病。

1.2儀器與試劑 采用四色流式細胞術檢測DNT，檢測儀器(EPIC SXL)及熒光標記單克隆抗體均購自貝克曼-庫爾特公司。

1.3方法 采集研究對象空腹靜脈血2 mL置于含有乙二胺四乙酸抗凝劑的真空采血管，在采集后6 h內處理標本。按照檢測標準，向編好順序的流式試管內分別加入10 μL單克隆抗體，隨即加入100 μL抗凝血，再混勻，避光，室溫孵育15 min后，分別加入溶血劑，溶解未標記細胞及紅細胞，按照操作程序上機檢測。

2 結 果

病例組患者的外周血DNT表達水平明顯低于對照組(t=4.194,P<0.01)。結締組織病相關性肺間質性肺疾病及特發性肺間質纖維化患者外周血DNT表達水平明顯低于對照組(P<0.01)。結締組織病相關性間質性肺疾病與特發性肺間質纖維化患者外周血DNT表達水平差異無統計學意義(P=0.948)，見表1。

表1 病例組與對照組DNT表達水平比較

3 討 論

間質性肺疾病的病因及分類較為復雜，人們目前發現的間質性肺疾病的病因約300余種，其發病機制具有一定的異質性[2]。間質性肺疾病起病原因各不相同，但最終病理特征大多表現為彌漫性肺泡炎癥和間質纖維化。其中重要的病理表現為彌漫性肺泡慢性炎癥、多種淋巴細胞及炎性因子參與慢性肺泡炎癥的過程。T淋巴細胞是其中重要的一種，其表面可表達多種抗原分子，根據這些分化抗原分子的不同，基本可劃分為CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞，而DNT是免疫調節T淋巴細胞的一種，其表面既不表達CD4也不表達CD8抗原。DNT約占人體外周血中CD3+T細胞的1%～3%，在機體免疫調節功能中發揮重要作用[3]。目前大多數研究發現DNT能夠抑制并殺死同種同源的CD4+和CD8+T淋巴細胞。有研究表明，DNT可通過細胞接觸Fas-FasL結合從而抗原特異性地抑制效應T細胞功能，并且能通過分泌白細胞介素(IL)-10等細胞因子，抑制T細胞和B細胞功能減少抗體產生[4]。但在其一些體外細胞研究中，人們發現DNT可分泌多種促進炎癥的細胞因子，如IL-1、IL-8、IL-17等，在感染性疾病中起到關鍵作用[5]。DNT是當前免疫學領域研究的熱點之一，在免疫調節、器官移植、排斥反應、自身免疫性疾病及腫瘤免疫耐受過程中發揮重要作用。本研究發現，與對照組相比較間質性肺疾病患者的DNT表達水平明顯下降。其中，特發性肺間質纖維化及結締組織病相關肺間質性肺疾病患者的DNT與對照組相比差異均有統計學意義。DNT低表達減弱對T淋巴細胞的抑制作用，從而加重了慢性肺泡炎的發生，提示DNT水平低表達在間質性肺疾病中可能起到一定病理生理作用。

近年來人們對于特發性肺間質纖維化的危險因素及發病機制研究取得較大的進展。CHU等[6]研究發現，特發性肺間質纖維化具有一定的遺傳易感性。通過全基因組測序，人們已經發現了多個與特發性肺間質纖維化發病相關的基因位點。在特發性肺間質纖維化的發病機制中肺泡上皮損傷學說獲得普遍認可。當外界損傷因素，如吸煙、環境污染、藥物等對肺泡上皮-間質造成損傷后可激發炎性反應，多種炎性細胞及T淋巴細胞被激活，并釋放多種細胞因子促進成纖維細胞的遷移與分化形成肺內多發纖維灶[7]。Th1/Th2細胞分泌的細胞因子失衡在其中起到關鍵作用，其中Th2細胞分泌的細胞因子明顯增加[8]。而DNT細胞表達水平的降低導致對Th2細胞抑制的減少可能參與該過程。

結締組織病可造成多系統損害，約30%的間質性肺病與結締組織病相關[9]。與特發性肺間質纖維化不同，自身免疫在本病中起到更為重要的作用。自身抗體可導致肺泡的上皮炎性反應和血管內皮損傷。同時肺泡內有多種細胞因子和生長因子的聚集，如：轉化生長因子-β、內皮素-1、胰島素樣生長因子、IL-1等。這些細胞因子和生長因子可激活纖維母細胞的活化促進肺間質纖維化的發生[10]。本研究發現，與對照組相比結締組織相關間質性肺疾病患者的DNT表達明顯下降，DNT表達水平的下調可能減弱對T淋巴細胞的抑制作用從而促進了CD4+T細胞的活化，從而導致促進肺泡和血管的炎性反應。

在診斷特發性肺間質纖維化時，排除結締組織病相關性肺間質纖維化十分重要。2011年美國胸科指南推薦，即使沒有相關的臨床癥狀所有特發性肺間質纖維化患者均應進行血清學自身抗體檢測[11]。在診斷特發性肺間質纖維化的患者中可以發現自身抗體輕度升高，但結締組織病表現較輕，沒有達到結締組織病相關性肺間質纖維化的診斷標準，但這部分患者經過數月或數年的隨訪后可表現出結締組織病特征性改變，進而修改間質性肺疾病的診斷[12]。在本研究中，特發性肺間質纖維化患者與結締組織病相關性肺間質性疾病患者的外周血DNT表達水平沒有差異，提示DNT可能在二者的發病過程中起到相似的作用，部分特發性肺間質纖維化患者只是某些結締組織病早期表現。臨床上對于二者的鑒別需要呼吸科與風濕免疫科醫生的密切合作[13]。

本研究通過比較不同間質性肺疾病患者與健康對照組DNT表達水平發現，DNT水平低表達可能在間質性肺疾病中起到一定的病理生理作用，從而進一步揭示了間質性肺疾病的發病機制，為尋找間質性肺疾病有效的治療靶點提供了新思路。但本研究也存在一些不足，如臨床樣本量尤其是其他類型的間質性肺疾病患者的例數較少，故本研究其他組間質性肺疾病的病例數據未作具體的統計分析。另外，有一些其他的研究發現系統性紅斑狼瘡、干燥綜合征等結締組織病患者外周血中的DNT表達明顯升高[14-15]，與本試驗的結果相反，可能與DNT本身存在不同來源和表型相關，不同表型的DNT發揮不同的免疫功能。本研究只回顧性分析了不同類型的間質性肺疾病中DNT表達水平的差異，而其在細胞、分子水平上的作用機制還有待進一步的探究。