刺山柑總生物堿對系統性硬皮病小鼠皮膚纖維化相關指標的影響*

康小龍，何承輝，盧 軍，劉 晶

(1.新疆醫科大學附屬中醫醫院藥研室，烏魯木齊 830000；2.新疆維吾爾自治區藥物研究所藥劑室，烏魯木齊 830004)

系統性硬皮病(systemic sclerosis,SSc)是一種結締組織疾病，表現為過量膠原在皮膚、肺、消化道等內臟器官沉積，以皮膚和內臟器官纖維化為特征[1-2]。刺山柑總生物堿系本課題組從新疆地產藥材刺山柑中提取的有效部位，擬用于SSc的治療。本實驗觀察了刺山柑總生物堿對SSc纖維化相關指標Ⅰ型膠原α1鏈(COL1A1)、纖維連接蛋白(Fn)、血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)和白細胞介素-1β(IL-1β)表達的調節作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 體質量(22.1±1.9)g清潔級雌性BALB/c小鼠90只，購自新疆實驗動物研究中心，合格證號：SCXK(新)2015-0027。

1.1.2藥材與試劑 刺山柑藥材(新疆麥迪森維藥有限公司飲片廠)；鹽酸博萊霉素粉針劑(日本化藥株式會社，批號：430312)；青霉胺片(上海信誼藥廠，批號：052130503)；小鼠Fn ELISA試劑盒(上海潤裕生物科技公司，批號：201601)；小鼠IL-1β ELISA試劑盒(美國R&D公司，批號：201603)；小鼠Ang Ⅱ ELISA試劑盒(上海江萊生物科技公司，批號：201602)；二辛可寧酸蛋白定量試劑盒(江蘇碧云天生物技術研究所，批號：20160320)；COL1A1抗體，β-actin抗體，HRP標記兔抗山羊IgG購自美國Santa Cruz公司；HRP標記山羊抗兔IgG購自美國Cell Signaling公司。

1.1.3主要儀器 酶標儀、低溫離心機(美國Thermo Fisher公司)；Western blot設備(美國Biorad公司)。

1.2方法

1.2.1SSc模型的建立及給藥方法 BALB/c小鼠采用隨機數字表法分為對照組、模型組、刺山柑總生物堿低(225 mg/kg)、中(450 mg/kg)、高(900 mg/kg)劑量組及陽性藥青霉胺(125 mg/kg)組，每組15只，博萊霉素皮下注射法建立SSc模型[3-4]：將小鼠背部中央區被毛剃除，鹽酸博萊霉素粉針劑用生理鹽水配成濃度為300 μg/mL的藥液，除對照組背部皮下注射生理鹽水外，其余各組注射博萊霉素，30 μg/d，注射4周后，刺山柑總生物堿各劑量組小鼠注射部位外敷刺山柑總生物堿乳膏，青霉胺組給予青霉胺灌胃，對照組、模型組背部外敷不含藥乳膏基質，每天1次，給藥8周。

1.2.2小鼠皮膚COL1A1表達檢測 給藥8周后，取小鼠背部皮膚，加入預冷的RIPA裂解液，組織勻漿機研磨成組織勻漿，濃度為10%，冰浴裂解30 min，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液，二辛可寧酸試劑盒定量上清液中蛋白水平，調整每孔上樣量，使每個加樣孔中總蛋白量相同，樣品與上樣緩沖液混合，95 ℃水浴中10 min變性蛋白，上樣后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，Tris-HCl-Tween洗膜后，加入COL1A1一抗(按1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL發光劑顯影，以β-actin做為內參，Image J軟件掃描條帶灰度，比較蛋白相對表達量。

1.2.3小鼠皮膚Fn表達檢測 給藥8周后，取小鼠背部皮膚，加入生理鹽水，組織勻漿機研磨成組織勻漿，濃度為10%，4 000 r/min離心10 min后提取上清液。上清液中Fn水平采用ELISA試劑盒測定，按試劑盒說明書進行操作，同時用二辛可寧酸蛋白定量試劑盒檢測上清液中總蛋白濃度，以每毫升上清液中總蛋白水平校正ELISA結果(pg/mg)。

1.2.4小鼠血清Ang Ⅱ和IL-1β水平檢測 給藥8周后，取血分離血清，Ang Ⅱ和IL-1β水平按ELISA試劑盒說明書進行測定。

2 結 果

2.1各組小鼠皮膚組織COL1A1表達水平 與對照組比較，模型組皮膚組織COL1A1表達增高(P<0.01)；與模型組比較，刺山柑總生物堿中、高劑量及陽性藥青霉胺可降低COL1A1表達(P<0.01)，見圖1。

A:Western blot檢測小鼠皮膚COL1A1蛋白水平；B：COL1A1灰度分析；a：P<0.01，與對照組比較；b：P<0.01，與模型組比較

圖1各組小鼠皮膚Ⅰ型膠原α1鏈(COL1A1)蛋白水平比較

2.2各組小鼠皮膚Fn表達水平 模型組小鼠皮膚組織Fn表達明顯高于對照組(P<0.01)；刺山柑總生物堿高劑量組和青霉胺組小鼠Fn水平顯著下降(P<0.05或P<0.01)；刺山柑總生物堿高劑量組與青霉胺組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.3各組小鼠血清Ang Ⅱ水平 模型組小鼠血清Ang Ⅱ水平明顯高于對照組(P<0.01)；刺山柑總生物堿高劑量組小鼠血清Ang Ⅱ水平較模型組明顯降低(P<0.05)，見表2。

表1 各組小鼠皮膚Fn水平比較

a：P<0.01，與對照組比較；b：P<0.05，c：P<0.01，與模型組比較

表2 各組小鼠血清Ang Ⅱ水平比較

a：P<0.01，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較

2.4各組小鼠血清IL-1β水平 模型組小鼠血清IL-1β水平明顯高于對照組(P<0.01)；各給藥組與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組小鼠血清IL-1β水平比較

a：P<0.01，與對照組比較

3 討 論

SSc是一種表現為多組織炎癥和纖維化的慢性自身免疫性疾病，目前認為SSc病因是由于過度活化的成纖維細胞(Fb)合成膠原、Fn和糖胺聚糖等增多，細胞外基質(ECM)沉積，引發組織纖維化[5-6]。Ⅰ、Ⅲ型前膠原主要由Fb合成，SScⅠ型前膠原合成較正常Fb升高，提示SSc以Ⅰ型前膠原增多為主[7-8]。將硬皮病Fb培養至第15代，其膠原合成量仍高于正常Fb，活化的Fb過量表達Ⅰ型前膠原，后者客觀反映了硬皮病的纖維化程度[9]。本實驗中，SSc模型組小鼠皮膚組織COL1A1和Fn表達顯著增高，刺山柑總生物堿中、高劑量可明顯降低COL1A1和Fn表達；本課題組已經證實：刺山柑總生物堿可使SSc小鼠真皮厚度變薄[10]，病理結果亦表明SSc小鼠皮膚和肺部炎癥和纖維化得到明顯改善[11]，提示刺山柑總生物堿可能通過抑制SSc纖維化形成過程中膠原合成及Fn表達，減少ECM沉積，改善SSc組織纖維化。

研究表明：SSc患者血清及皮損中Ang Ⅱ水平升高，體外培養的SSc患者真皮Fb中Ang Ⅱ表達上調，血管緊張素原的合成增加，皮膚及肺Fb血管緊張素受體1(AT1)和AT2受體表達上調。Ang Ⅱ與AT1結合后可誘導Fb合成轉化生長因子-β，刺激α-平滑肌肌動蛋白在Fb中表達增高，膠原及Fn等ECM成分過度合成，促使膠原基質收縮及組織纖維化形成，因此認為Ang Ⅱ異常表達可促進SSc組織纖維化的形成[12]。本研究中，模型組小鼠血清Ang Ⅱ水平升高，刺山柑總生物堿高劑量可降低SSc小鼠Ang Ⅱ水平，提示刺山柑總生物堿可能通過降低Ang Ⅱ水平，抑制SSc纖維化形成。

自身免疫功能紊亂和炎性反應是SSc的病程初期的表現，導致細胞因子網絡調節失衡，許多促炎因子如IL-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等分泌增加，一方面，Fb被這些促炎因子激活后合成ECM增加；另一方面血管內皮細胞受損后釋放促炎因子，后者激活Fb，最終造成小血管纖維化和組織炎性反應[13]。因此，抑制IL-1β、TNF-α等炎癥相關因子的合成、分泌，阻斷炎癥信號轉導通路可能在SSc早期階段具有重要的治療前景。本研究在對各組小鼠血清IL-1β水平檢測后表明模型組IL-1β水平明顯增高，提示IL-1β可能參與了SSc的形成，各受試藥組與模型組比較IL-1β水平差異沒有顯著性意義，提示刺山柑總生物堿可能不能降低升高的SSc IL-1β水平。

本研究表明刺山柑總生物堿可能通過降低Ang Ⅱ水平，抑制SSc纖維化形成過程中膠原合成及Fn表達，減少ECM沉積，改善SSc組織纖維化，但刺山柑總生物堿如何降低Ang Ⅱ水平及Ang Ⅱ水平降低后如何調控下游信號通路的傳導，從而抑制膠原合成及Fn表達等問題目前還不清楚，將成為本課題組今后研究的方向。