肺癌中SOX4基因的調控網絡分析驗證和蛋白質預測

李明陽，馬春霞，吳翰欣，吳小海，俞建昆

1.中國醫學科學院北京協和醫學院 醫學生物學研究所中心實驗室，云南 昆明 650118；

2.昆明醫學大學 附屬第二醫院，云南 昆明 650118

SOX（SRY-related HMG-box）家族作為一類轉錄因子，參與調控胚胎的發育和分化，也參與胚胎發育中的性別決定、神經系統形成和血管系統發育等過程。該家族成員含有一段高度保守的HMG-Box序列，具有DNA結合蛋白的特性。近年來隨著高通量測序技術及基因芯片技術的發展[1-3]，在多種惡性腫瘤中發現該家族的重要成員之一SOX4表達異常。目前已有相關報道證明SOX4基因與肺癌相關，對肺癌的診斷、治療、療效及預后評估等均有重要意義[4-5]。該基因在肺癌中受到的調控機制尚未完全明晰。因此，我們利用生物信息學方法對SOX4基因可能存在的調控機制進行了預測，為進一步證明該基因與肺癌的關系奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

自NCBI的GenBank數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）檢索并下載人類（HOMO）SOX4基因全長序列及編碼蛋白的氨基酸序列（HOMO ID：6659，NC_000006.12），保存為FASTA格式以便進行后續分析。

1.2 生物信息學預測

用 Protparam（http://web.expasy.org/protparam/）、SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）和SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）工具分析SOX4基因的蛋白產物；用在線分析軟件GCBI（https://www.gcbi.com.cn/）分析SOX4基因的調控網絡。

1.3 實時熒光定量PCR

利用特異性莖環引物對目標微小RNA（microRNA，miRNA）進行反轉錄，引物見表1。檢測儀器為Roche Light Cycle 480Ⅱ，試劑為HiScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis kit和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix。細胞系樣品為正常人胚肺成纖維細胞（KMB17）和肺癌細胞系（A549和H1299），臨床樣本為20對肺癌病人癌組織與癌旁組織（昆明醫科大學腫瘤醫院提供）。

表1 引物及序列

2 結果

2.1 SOX4蛋白相關指數測定

人類SOX4蛋白分子組成為C14497H24117N4879O6053S1249，相對分子質量403 657.95。共有4879個氨基酸殘基，其中甘氨酸殘基含量最高為26.9%，等電點4.71。在哺乳動物體外，該蛋白的半衰期為4.4 h，不穩定指數為46.53，因此判定為不穩定蛋白。溶脂系數為23.45，親水性的總平均值為0.786。

2.2 SOX4蛋白互作網絡分析

如圖1所示，通過在線預測，人SOX4蛋白可與TP53、DICER1和SDCBP2蛋白相互作用。

圖1 人類SOX4蛋白互作圖

2.3 SOX4基因調控網絡分析

如圖2、3所示，人SOX4基因受多種長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和miRNA的調控，其中miRNA-30家族未有文獻報道證實其與SOX4存在調控關系，因此我們對miRNA-30s進行qPCR測定。

圖2 可能調控SOX4基因的lncRNA

圖3 可能調控SOX4基因的miRNA

2.4 qPCR驗證miRNA-30s表達量

如圖4、5所示，hsa-miR30s在臨床樣本中的表達模式不完全相同。與癌旁組織相比，hsamiR30c-5p和hsa-miR30d-5p在癌組織中低表達，而hsa-miR30d-5p則相反；與正常人胚肺成纖維細胞KMB17相比，肺癌細胞系A549和H1299中3個miRNA-30成員的表達模式均為高表達，這也與前期預測相反。

圖4 臨床樣本中miRNA-30s的表達量

圖5 細胞系中miRNA-30s的表達量

3 討論

作為胚胎發育中調節增殖和分化的基因，SOX4在肺癌中顯著高表達，提示其與腫瘤的發生發展有關。現有研究證明SOX4基因可調節細胞信號通路，影響細胞增殖、分化和凋亡等過程，并利用miRNA調控網絡促進或抑制腫瘤生長[6-9]。但該基因在肺癌中的具體機制尚未完全明確，因此我們利用生物信息學分析方法對SOX4基因可能存在的調控機制進行了預測。研究結果顯示，SOX4蛋白可與TP53、DICER1和SDCBP2蛋白發生相互作用；在基因水平上，SOX4基因受多種lncRNA和miRNA的調控。miRNA與目標基因一般為負性調控模式[10-12]，而本研究中qPCR結果與前期預測并不完全一致，由此提示雖然生物信息學可在前期為實驗設計開辟道路，但僅靠生物信息學的分析結果并不十分嚴謹，必須將軟件預測分析和實驗驗證結合起來，方能得到可信度最高的結果，為進一步證明目標基因與疾病的關系提供科學有效的數據基礎。