巨細胞病毒IgG抗體檢測試劑盒（酶聯免疫法）的性能驗證

楊洋，吳恩應，陳玉琴，劉愛和，吳灼斌，林桓旭，黃偉榮，李彬，郭采平

深圳市衛光生物制品股份有限公司 藥物研發中心，廣東 深圳 518107

人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是皰疹病毒科β屬的DNA病毒，在人群中傳播廣泛，我國成人的感染率超過95%，且巨細胞病毒的感染與地區、年齡、經濟狀況相關[1]。一般成人感染后臨床癥狀較輕或不明顯，但孕婦感染后可引起胎兒流產、死胎、先天性畸形及智力低下，還可導致器官移植等免疫功能低下的患者死亡[2-4]。因此，巨細胞病毒感染的早期快速診斷對控制巨細胞病毒傳播、促進優生優育、降低器官移植患者死亡率有重要意義。我們采用間接ELISA法研制了巨細胞病毒IgG抗體檢測試劑盒，對其性能進行了驗證，為該試劑盒制定企業注冊標準和確定生產工藝提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人巨細胞病毒抗原、抗人IgG-HRP購自深圳市菲鵬生物股份有限公司；新生牛血清購自武漢三利生物技術有限公司；牛血清白蛋白（BSA）購自MP Biomedicals公司；96孔微孔板購自深圳市金燦華公司；TMB、Tween-20購自Amresco公司；巨細胞病毒IgG抗體參考品購自中國食品藥品檢定研究院（標準物質編號360004，批號201101，以下簡稱“國家參考品”）；巨細胞病毒IgG抗體企業參考品為深圳市衛光生物制品股份有限公司自產（批號20140710，以下簡稱“企業參考品”）；參比試劑巨細胞病毒IgG抗體診斷試劑盒（酶聯免疫法）購自珠海經濟特區海泰生物制藥有限公司（批號20140606，以下簡稱“參比試劑”）；待考核試劑為巨細胞病毒IgG抗體檢測試劑盒（酶聯免疫法），由本公司研制（批號20140701、20140702、20140703，以下簡稱“待考核試劑”）；第三方試劑巨細胞病毒IgG抗體檢測試劑盒（增強化學發光免疫分析法）購自北京泰格科信生物科技有限公司（批號20140603，以下簡稱“第三方試劑”）；其余普通化學試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司；實驗樣本來源于深圳市第二人民醫院、深圳市衛光生物制品股份有限公司單采血漿站。MK3酶標儀購自Thermo公司；PW-960全自動酶標洗板機購自深圳匯松公司；MB-1酶標板脫水機購自北京天石醫療公司；DK-600電熱恒溫水浴箱購自上海精宏公司；KBF.720恒溫恒濕箱購自德國賓得公司。

1.2 HCMV IgG的檢測

將待檢樣品按1∶101稀釋，即取待測樣品10 μL至1000 μL樣品稀釋液中，充分混勻，每孔加100 μL；設立空白對照2孔（從加底物開始實驗），陰性對照、陽性對照和臨界對照各2孔；覆蓋封板膜，置37℃孵育30 min；取出已孵育完畢的反應板，棄去封板膜；洗板機洗板4次，300 μL/孔，浸泡20 s，干板；每孔加入酶結合物100 μL（空白對照孔除外），覆蓋封板膜，置37℃孵育30 min；取出已孵育完畢的反應板，棄去封板膜，洗板4次，干板；加入100 μL TMB顯色液（包括空白對照孔），輕輕振蕩混勻；覆蓋封板膜，置37℃避光孵育15 min；每孔加入100 μL終止液終止反應；終止后30 min內用酶標儀讀取吸光度值，取單波長450 nm或雙波長450 nm/630 nm測量。

1.3 HCMV IgG檢測試劑盒的性能驗證

1.3.1 技術指標 依據中華人民共和國醫藥行業標準《YY/T 1183-2010酶聯免疫吸附法檢測試劑（盒）》和《YY/T 1236-2014巨細胞病毒IgG/IgM抗體檢測試劑（盒）》，對試劑盒的外觀、陽性參考品符合率、陰性參考品符合率、重復性、檢測限、批間差進行檢測[6-7]。

1.3.1.1 外觀 試劑盒外包裝應完整，無破損；各組分應齊全、完整，液體應密封無泄漏；酶標板條應平整、無飛邊、表面光潔度好、底部無波紋及劃傷；液體組分應澄清透明，無絮狀物；標識應清晰，易識別。

1.3.1.2 陽性參考品符合率 對10份陽性參考品進行檢測，其結果應不得出現假陰性。

1.3.1.3 陰性參考品符合率 對5份陰性參考品進行檢測，其結果應不得出現假陽性。

1.3.1.4 重復性 用重復性參考品重復檢測10次，CV應≤15.0%。

1.3.1.5 檢測限 對3份最低檢出限參考品進行檢測，應均能檢出。

1.3.1.6 批間差 用3個批號的試劑盒分別對國家參考品L1、R、N1（強陽、弱陽、陰性）、企業參考品l1、r、n1（強陽、弱陽、陰性）進行測定，各10個復孔，計算30次結果的吸光度值值均數、標準差（SD）及變異系數（CV值）。

1.3.2 對比實驗研究 用本公司研制的巨細胞病毒IgG抗體檢測試劑盒（酶聯免疫法）與珠海經濟特區海泰生物制藥有限公司的巨細胞病毒IgG抗體診斷試劑盒（酶聯免疫法）同時檢測1050例樣本，進行對比實驗研究[8-12]。

1.4 統計學分析

采用SPSS軟件進行統計學分析。求出χ2檢驗、一致性系數Kappa值（κ），考察評價試劑與參比試劑檢測結果的一致性及是否具有統計學意義上的差異。

2 結果

2.1 技術指標的驗證

20170701、20170702、20170703批試劑盒檢測10份陽性參考品（國家參考品，P1～P10），準確性（陽性符合率）均為100%；3批試劑盒分別檢測5份陰性參考品（國家參考品，N1～N5），特異性（陰性符合率）均為100%；重復性CV值分別為1.7%（20140701批）、4.9%（20140702批）和 4.8%（20140703批）；批間變異系數分別為3.9%（強陽性）、7.2%（弱陽性）和5.3%（陰性），均小于等于15.0%；3份最低檢出限國家參考品L1、L2、L3均能檢出，且均為陽性。

20170701、20170702、20170703批試劑盒檢測10份陽性參考品（企業參考品，p1～p10），準確性（陽性符合率）均為100%；3批試劑盒分別檢測5份陰性參考品（企業參考品，n1～n5），特異性（陰性符合率）均為100%；重復性CV值分別為4.6%（20140701批）、3.6%（20140702批）和 1.9%（20140703批），批間變異系數分別為5.9%（強陽性）、5.9%（弱陽性）和6.1%（陰性），均小于等于15.0%；3份最低檢出限參考品L1、L2、L3均能檢出，且均為陽性。

以上技術指標均符合中華人民共和國醫藥行業標準《YY/T 1183-2010酶聯免疫吸附法檢測試劑（盒）》、《YY/T 1236-2014巨細胞病毒IgG/IgM抗體檢測試劑（盒）》的要求。同時，將20140701、20140702、20140703批試劑盒送中國食品藥品檢定研究院檢定，所檢技術指標項目全部合格。

2.2 對比實驗研究

用本公司研制的巨細胞病毒IgG抗體檢測試劑盒與已上市的珠海海泰巨細胞病毒IgG抗體診斷試劑盒（酶聯免疫法）（國食藥監械（準）字2013第3400423號）對1050份血清標本進行檢測，可疑樣本未進入計算。表4給出了診斷試驗中常用的評價指標，本公司試劑盒的陽性符合率為98.92%（95%置信區間：98.18%～99.66%），陰性符合率為98.60%（95%置信區間：97.24%～99.96%），與已上市試劑盒的總符合率為98.83%（95%置信區間：98.17%～99.49%），假陽性率為1.40%，假陰性率為1.08%，陽性試驗的預示值為99.46%，陰性實驗的預示值為97.24%，Youden指數為0.9752，Kappa系數為 0.9710，一致性優，配對χ2檢驗的P＞0.05，待考核試劑和對比試劑的檢測結果不一致部分不存在統計學意義上的差異。

1050例樣本中，結果不一致的樣本共有23例（其中13例第三方試劑與評價試劑測定結果一致，7例第三方試劑與對比試劑測定結果一致）。推斷其原因可能是樣本中巨細胞病毒IgG抗體含量位于待考核試劑最低檢出限附近，同時樣本和稀釋液沒有充分混勻，加樣后讀取試驗結果的時間較早所致。

表1 國家參考品驗證結果

表2 批間變異系數檢測結果（n=30）

表3 企業參考品驗證結果

表4 2種試劑盒檢測1050例樣本的結果

3 討論

檢測巨細胞病毒IgG抗體的免疫學方法有中和試驗、補體結合試驗、間接血凝試驗、酶聯免疫法、放射免疫法等[13]，但只有酶聯免疫法具備操作簡便、靈敏度高、特異性好、技術成熟的優點，且用于常規實驗室[14-15]。

本公司研制的巨細胞病毒IgG抗體檢測試劑盒（酶聯免疫法）按中華人民共和國醫藥行業標準《YY/T 1183-2010酶聯免疫吸附法檢測試劑（盒）》、《YY/T 1236-2014巨細胞病毒IgG/IgM抗體檢測試劑（盒）》對國家參考品和企業參考品進行檢測，各項指標均合格。珠海經濟特區海泰生物制藥有限公司的酶聯免疫法試劑盒的有效性已經得到國內權威部門的認可，很多研究都使用該試劑盒做比對試驗[16-17]，顯示了其較好的性能，可信度高。在本次對比研究中，收集血清樣本1050例，使用本公司研制的巨細胞病毒IgG抗體檢測試劑盒（酶聯免疫法）與珠海經濟特區海泰生物制藥有限公司的巨細胞病毒IgG抗體診斷試劑盒（酶聯免疫法）分別測定樣本中巨細胞病毒IgG抗體，χ2檢驗的P＞0.05，待考核試劑與對比試劑檢測不一致的部分不存在統計學意義上的差異，一致性分析Kappa系數為0.9710，表明一致性優（κ＞0.75，表明一致性優；κ在0.40～0.75之間為一致性良好；κ＜0.4則表示一致性較差），即2種試劑盒有高度的一致性，有臨床應用價值，對相關疾病可以提供有效的診斷和治療依據。此外，可以依據中華人民共和國醫藥行業標準《干擾實驗指南WS/T 416-2013》、《弓形蟲、風疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒抗體及G型免疫球蛋白抗體親和力檢測試劑技術審查指導原則》完成交叉、干擾實驗，完善分析性能評估資料。

連續研制3批試劑盒，經以上性能評估，各批產品檢測結果符合相關要求和規定，可為完善試劑盒的產品技術要求和產品說明書提供指引。