芽孢桿菌產溶藻活性物質的環(huán)境穩(wěn)定性研究

司曉光，張曉青，郝建安，杜瑾，張愛君，曹軍瑞

國家海洋局 天津海水淡化與綜合利用研究所，天津 300192

作為一種全球性海洋災害，赤潮已經引起世界各國的高度關注。科研人員進行了諸多研究和探索，以應對頻繁發(fā)生的赤潮災害，以期能有效地防治赤潮，減少其引發(fā)的危害和損失[1-3]。

微生物具有種類多、繁殖迅速、功能豐富等特點，因此在治理赤潮中具有極大的優(yōu)勢。近年來，科研人員對赤潮的微生物防治方法進行了大量研究，取得了一些很好的成果，其中利用微生物自身分泌的具有溶藻作用的胞外物質進行溶藻是目前研究的熱點[4-6]。迄今，已報道的溶藻活性物質主要包括蛋白質類、氨基酸類、多肽類、表面活性劑、抗生素等[7-10]。

微生物產生的溶藻活性物質對環(huán)境條件的要求較高，對其實際應用有一定的影響[11-14]。為此，我們研究了本實驗室獲得的芽孢桿菌產溶藻活性物質的環(huán)境穩(wěn)定性，探討其對溫度、酸堿度、反復凍融的耐受性以及貯存時的活性衰減周期，獲得了最佳使用、運輸和貯存條件，為該活性物質在赤潮治理中的實際應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

芽孢桿菌（Bacillus）dhs-330-021為本實驗室保存菌種，由dhs-330轉座突變庫篩選獲得；鏈狀亞歷山大藻（Alexandrium catenella）購自上海光語生物科技有限公司，為典型赤潮藻。

dhs-330-021發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖32 g（單獨滅菌），尿素5.0 g，酵母提取物1.2 g，Na2HPO4·12H2O 3.0 g，KH2PO40.8 g，MgSO4·7H2O 0.15 g，微量元素溶液（CaCl27.5 g/L，FeSO4·7H2O 2.0 g/L，MnSO4·H2O 2.0 g/L）1.0 mL，定容至1 L并調整pH至7.0，115℃滅菌30 min。

鏈狀亞歷山大藻培養(yǎng)基（f/2培養(yǎng)基）：NaNO3（75.0 g/L）1 mL，NaH2PO4·H2O（5.0 g/L）1 mL，NaSiO3·9H2O（30.0 g/L）1 mL，微量元素溶液［FeCl3·6H2O 3.15 g，Na2EDTA·2H2O 4.36 g，CuSO4·5H2O（9.8 g/L）1 mL，NaMoO4·2H2O（6.3 g/L）1 mL，ZnSO4·7H2O（22.0 g/L）1 mL，CoCl2·6H2O（10.0 g/L）1 mL，MnCl2·4H2O（180.0 g/L）1 mL，用水定容至1 L］1 mL，維生素溶液［維生素B1200 mg，維生素H（1.0 g/L）1 mL，維生素B12（1.0 g/L）1 mL，用水定容至1 L］0.5 mL，用過濾海水定容至1 L。

1.2 溶藻物質分離

將dhs-330-021接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，取50 mL，10 000 r/min離心15 min，上清液經0.22 μm濾膜過濾除菌，再用0.22 μm濾膜過濾至無菌藍蓋瓶中，獲得溶藻活性物質。

1.3 溶藻物質的溫度耐受性實驗

將獲得的溶藻活性物質水浴，分別加熱到20、30、40、50和60℃，保溫24 h，再冷卻至室溫，加到鏈狀亞歷山大藻的藻液中，添加量為2%，光照強度2500 lx，光暗比12 h∶12 h，每隔 24 h取樣，用血球計數器計數。

1.4 溶藻物質的酸堿耐受性實驗

將獲得的溶藻活性物質用0.2 mol/L的HCl和0.2 mol/L的NaOH調節(jié)pH值分別至3.0、5.0、7.0、9.0和11.0，室溫放置24 h，再用0.2 mol/L的NaOH和0.2 mol/L的HCl調節(jié)pH值為7.0，分別加到鏈狀亞歷山大藻的藻液中，添加量為2%，光照強度2500 lx，光暗比12 h∶12 h，每隔24 h取樣，用血球計數器計數。

1.5 反復凍融對溶藻物質的影響

將溶藻活性物質置于-20℃冰箱中冷凍后取出，室溫融化，反復冷凍融化5、10、15和20次，與未經凍融的溶藻物質對照進行實驗，分別加到鏈狀亞歷山大藻的藻液中，添加量為2%，光照強度2500 lx，光暗比12 h∶12 h，每隔24 h取樣，用血球計數器計數。

1.6 溶藻物質的活性衰減周期

將獲得的溶藻活性物質于4℃冰箱中保存，分別取放置時間為0、1、3、6、9、12個月的溶藻活性物質添加到藻細胞液中，添加量為2%，光照強度2500 lx，光暗比12 h∶12 h，每隔24 h取樣，用血球計數器計數。

2 結果

2.1 溫度對溶藻物質的影響

圖1結果顯示，隨著處理時間的增加，藻細胞密度逐漸降低，20℃處理組的藻液培養(yǎng)96 h后藻細胞密度為0.62×103/mL，與初始藻細胞密度1.83×104/mL相比，溶藻率為96.6%，而30、40、50和60℃處理組的溶藻率分別為97.2%、97.8%、89.2%和83.9%，可見在50℃以下溶藻活性物質的熱穩(wěn)定性較好。

圖1 處理溫度對溶藻物質活性的影響

2.2 pH值對溶藻物質的影響

從圖2實驗結果可以看出，處理96 h后不同pH值處理組的藻細胞密度不同，對照組和pH11處理組的藻細胞密度明顯高于其他組。分析數據發(fā)現，對照組和pH11處理組的溶藻物質對藻細胞沒有抑制作用，藻細胞均呈增加的趨勢，而pH3、pH5、pH7和pH9處理組的溶藻率分別為95.2%、95.0%、95.2%和87.5%。由此可以得出，溶藻活性物質在強堿性條件（pH11）下失去溶藻活性，但能耐受弱堿和酸性條件，酸堿耐受范圍為pH3～9。

2.3 反復凍融對溶藻物質的影響

圖3顯示了添加不同凍融次數的溶藻物質對藻細胞密度的影響。可以看出添加不同凍融次數的溶藻物質對藻細胞密度有一定的影響，凍融0、5、10、15和 20次組的溶藻率分別為 97.6%、97.2%、94.3%、89.8%和86.9%，呈現逐漸降低的趨勢，這表明反復凍融對溶藻物質的活性有一定的影響，凍融15次內仍能保持90%以上的溶藻率，可以認為對反復凍融具有一定的耐受性。

圖2 酸堿度對溶藻物質活性的影響

圖3 反復凍融對溶藻物質活性的影響

2.4 溶藻物質的活性衰減周期

圖4中的曲線表示貯存時間對溶藻物質溶藻活性的影響，結果表明隨著時間的延長，溶藻物質的活性逐漸降低，貯存6個月內的溶藻率仍保持在90%以上，可以認為是一種比較穩(wěn)定的溶藻物質。

3 討論

溶藻物質的種類繁多，結構性質差異較大，對環(huán)境穩(wěn)定性的要求也不同。魏雅冬等發(fā)現的一株溶藻細菌產的胞外物質具有很強的熱穩(wěn)定性，121℃處理后仍有很好的溶藻效果，但在強酸性（pH2.0）條件下喪失活性[15]。汪輝等發(fā)現了一株無色桿菌屬的菌株能分泌一種耐高溫和蛋白酶處理的活性物質，該物質能強烈抑制銅綠微囊藻的生長[16]。

我們對芽孢桿菌dhs-330-021產的溶藻物質的環(huán)境穩(wěn)定性研究表明，該物質對溫度的耐受性較好，隨溫度的升高溶藻率逐漸下降，50℃時仍能維持90%以上的溶藻率；同時，該物質對溫度的變化不敏感，反復凍融15次內，溶藻率仍大于90%。酸堿耐受性實驗結果表明，pH3～9時該物質的溶藻率為87.5%～95.2%，pH11時則喪失溶藻活性，具有耐酸不耐強堿的特性。另外，該物質在常溫貯存條件下，溶藻活性逐漸降低，6個月內的溶藻率仍能保持90%以上。綜上，該物質具有很好的環(huán)境穩(wěn)定性，便于運輸和儲存，是一種具有很好應用前景的溶藻活性物質。

圖4 貯存時間對溶藻物質活性的影響