初步探討等量稀釋法解決黃疸標本引起的LH750儀白細胞無法分類的問題

陳敬潮 周東銘 連斯敏 張蘇偉

[摘要] 目的 探討血液細胞分析儀無法分類的黃疸標本，通過生理鹽水等量稀釋后其白細胞分類結果準確性和可靠性。 方法 將無白細胞分類計數結果的黃疸標本與生理鹽水等倍稀釋后在LH750儀上機進行檢測，將稀釋后的白細胞分類計數結果與原血液標本在XN-1000血細胞分析儀的計數結果做對比，分析稀釋后的黃疸標本的白細胞分類結果與原血液標本白細胞分類是否有差異。 結果 生理鹽水稀釋的黃疸標本，WBC<2.0×109/L時，相對偏差最小為0%，最大為9.03%；WBC>2.0×109/L時，相對偏差最小為0.09%，最大為5.21%，均符合要求。 結論 生理鹽水等量稀釋法可用于初步解決黃疸標本白細胞無法分類計數的問題。

[關鍵詞] LH750血細胞分析儀；白細胞五分類；比對試驗；高膽紅素

[中圖分類號] R446.111 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2018）13-0111-04

Preliminary discussion on using equal dilution to solve the problem that LH750 could not classify white blood cells caused by Jaundice specimen

CHEN Jingchao ZHOU Dongming LIAN Simin ZHANG Suwei

Department of Clinical Laboratory， Shantou Central Hospital in Guangdong Province， Shantou 515041， China

[Abstract] Objective To investigate the accuracy and reliability of white blood cell classifications in normal saline diluted jaundice specimen which could not be classified by blood cell analyzer. Methods Jaundice specimens which not be classified were equally diluted with normal saline and assessed in LH750. Differential count of white blood cells after dilution was compared with the result of original specimen using XN-1000 blood cell analyzer. The white blood cell classifications of diluted jaundice specimen and the original blood sample were analyzed. Results In jaundice specimens diluted by normal saline， when WBC<2.0×109/L， minimum relative deviation was 0% and the maximum was 9.03%. When WBC>2.0×109/L， minimum relative deviation was 0.09% and the maximum was 5.21%. All the results met the requirements. Conclusion Equal dilution of normal saline could preliminarily solve the problem that white blood cells could not be classified in jaundice specimen.

[Key words] LH750 blood cell analyzer； Five classifications of white blood cells； Comparison test； Hyperbilirubinemia

臨床檢驗中，除去實驗室儀器本身性能有一定的局限性，其他非儀器因素包括血液狀態、藥物濃度等亦會對檢驗過程形成干擾，導致血液檢測出現異常結果。如黃疸標本有時也會干擾血常規中的白細胞分類結果，影響疾病的準確判斷等。貝克曼庫爾特LH750五分類血細胞分析儀采用V（容量）、C（電導）、S（光散射）的原理[1]，臨床檢驗中大多數的血液標本進行血常規白細胞五分類計數均用此法，快速準確。對于檢驗過程中出現的黃疸標本，常出現白細胞分類不準確甚至無法分類的情況。出現此異常可能是因為黃疸對光散射造成的干擾，或是膽紅素含量過高造成的其他影響。希森美康XN-1000儀采用半導體激光流式細胞技術結合核酸熒光染色技術進行白細胞計數和分類。半導體激光照射在通過鞘流技術處理的細胞上，可根據每個細胞所產生的三種信號來鑒別細胞類別，更大程度上減少其他因素對血細胞分類形成的干擾，包括上述提到的黃疸血液標本中的高膽紅素干擾，可準確地對黃疸標本進行白細胞分類計數。本實驗擬將LH750儀白細胞無法分類的黃疸標本等量稀釋后重新在LH750進行分類計數并評價其白細胞分類結果的可靠性。本文現對2016年11～12月出現的共28例黃疸標本，取500 μL黃疸標本與等量生理鹽水混勻后于LH750進行白細胞分類計數，將其結果與原標本在XN-1000儀所得的分類結果進行比較分析，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本選擇

選擇2016年11～12月來自我院送檢標本中LH750儀無法進行白細胞分類計數，經生化檢查總膽紅素濃度增高的標本（總膽紅素>34.2 μmol/L）：共28例。所有標本均采血2 mL于EDTA-K2抗凝的真空采血管，于2 h內完成標本檢測。

1.2 儀器和試劑

貝克曼庫爾特LH750血細胞分析儀，專用試劑LH稀釋液，Coulter Clenz清洗液，Coulter血細胞分析儀系列溶血劑，Coulter白細胞五分類試劑包（Beckman Coulter實驗系統（蘇州）有限公司，中國）；希森美康XN-1000血細胞分析儀，專用稀釋液：濃縮稀釋液DST，稀釋液DCL，專用溶血劑與染色液：溶血劑WDF、溶血劑WDF（染色液）、溶血劑WNR、溶血劑WNR（染色液）、稀釋液DFL、溶血劑RET（染色液）、溶血劑PLT（染色液）、溶血劑SLS、溶血劑WPC、溶血劑WPC（染色液）（希森美康醫用電子（上海）有限公司，中國）；0.9%的生理鹽水。

1.3方法

1.3.1 0.9%生理鹽水配置 準確稱取0.90 g的氯化鈉粉末，溶解于少量蒸餾水中，繼續稀釋至100 mL，搖勻。

1.3.2 驗證LH750儀與XN-1000檢測結果之間的可比性 根據《WT/T406.-2012 臨床血液學檢驗常規項目分析質量要求》[2]：使用20份臨床EDTA-K2抗凝全血樣本分別在LH750儀與XN-1000儀兩臺儀器上嚴格按照標準操作程序進行雙份測定，收集白細胞總數，白細胞五分類百分比，2 h內完成檢驗。以XN-1000的測定結果為標準，計算相對偏差，其中比對樣本的白細胞總數WBC<2.0×109/L，2.0～5.0×109/L，5.0～11.0×109/L，11.1～50.0×109/L，>50.1×109/L的樣本數量所占比例應分別達10%、10%、45%、25%、10%。故選擇當天實驗前2 h內在LH750儀上測得的符合上述白細胞濃度檢測要求的臨檢標本各2、2、9、5、2例，置于兩儀器重新進行白細胞五分類計數。根據同實驗室兩儀器白細胞五分類結果進行比較，差異有無統計學意義（置信區間95%）來表明LH750儀與XN-1000在白細胞分類計數方面的相對偏差是否在臨床可接受范圍內。

1.3.3 血常規檢測 取LH750儀檢驗過程中出現的白細胞無法分類的黃疸標本，記錄總膽紅素水平，吸取黃疸全血標本500 μL與等量生理鹽水混合后，在LH750儀上重新計數，稀釋后的樣本不再出現無法分類的情況，散點圖異常也恢復了正常圖譜，并記錄白細胞五分類比例結果。同時將原黃疸標本于希森美康XN-1000儀進行檢測，記錄白細胞五分類結果。比較兩儀器所得五分類百分比的結果，分析稀釋后的白細胞分類結果與比對儀器的結果是否存在顯著性差異。

1.4 統計學方法

將28例稀釋后的標本用LH750儀檢測得出白細胞五分類的百分比，與對應標本在XN-1000所檢測的的數據進行比較分析：采用SPSS 16.0統計學軟件包進行數據處理，采用配對設計資料的Wilcoxon符號秩和檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。將20例全血標本分別在兩儀器上所測得的白細胞五分類進行比較，采用線性回歸分析兩儀器間的可比性：以Sysmex XN-1000血細胞分析儀測定結果為X值，Beckman LH750血細胞分析儀測定結果為Y值，：計算相對偏差（%）表示，相關性用r2表示。相對偏差要求參照《WT/T406.-2012 臨床血液學檢驗常規項目分析質量要求》，r2越接近1，擬合度越高。

2 結果

2.1 LH750儀白細胞無法分類計數的黃疸標本

共28例，標本分布在消化內科、普外一科、普外二科、腎內科，均伴隨TBIL增高，其中TBIL<100 μmol/L、100～200 μmol/L、200～300 μmol/L、300 μmol/L以上分別有6、9、4、9例，28例黃疸標本在LH750儀數據結果如下：提示NRBC假性計數，白細胞無分類結果，白細胞總數與XN-1000儀上的結果相比呈現明顯增高的趨勢，白細胞直方圖、散點圖圖像出現異常。觀察白細胞散圖分布，左下方有數量不等的紅色干擾散點，且隨著膽紅素濃度增高，干擾散點增多（封三圖4～5）。

2.2 LH750儀與XN-1000的比對試驗

實驗室結果可比性以相對偏差為評價指標，表1結果符合《WT/T406-2012 臨床血液學檢驗常規項目分析質量要求》要求：共對20例血液標本進行檢驗（表1），每份標本分別使用XN-1000與LH750儀進行檢驗計數白細胞總數。以XN-1000檢測結果為標準，計算相對偏差（要求WBC<2.0時相對偏差小于10.0%，其余相對偏差<7.5%）。實驗結果中20例標本計算所得的相對偏差中，WBC<2.0×109/L時，相對偏差最小為0%，最大為9.03%；WBC>2.0×109/L時，相對偏差最小為0.09%，最大為5.21%，均符合要求，表明LH750儀與XN-1000在WBC計數方面的相對偏差在臨床可接受范圍內，可用XN-1000儀來驗證LH750儀的結果。表2是LH750儀所檢測得的上述20例標本白細胞五分類結果與對照儀器XN-1000比較，中性粒細胞（Neut.）、淋巴細胞（Lym.）、單核細胞（Mon.）相關性較好，r2分別是0.970、0.969、0.903；嗜酸性粒細胞（Eos.）次之，r2=0.859，嗜堿性粒細胞（Baso.）的r2=0.586，相關性欠佳。故可在接下來用XN-1000儀測得的白細胞分類結果作為此黃疸標本白細胞分類百分比結果，代替無法對黃疸標本進行白細胞分類計數的LH750儀的檢測計數，與用生理鹽水稀釋后的樣本白細胞分類百分比結果做比較分析。

2.3 LH750儀與XN-1000五分類結果的差異性驗證

稀釋后的黃疸標本在LH750儀的五分類結果與原黃疸標本在XN-1000儀檢測結果進行比較：將LH750白細胞五分類結果與XN-1000白細胞五分類結果進行整理，因五種白細胞數據均不符合正態分布，用Wilcoxon符號秩和檢驗，觀察Z值（表3），可得Neut、Mon、Lym、EOS、Baso五種白細胞雙側檢驗P值分別為0.133、0.339、0.933、0.187、0.344，故P>0.05，不可以認為稀釋后的五分類比例與真實值存在顯著差異。

3討論

LH750儀利用VCS技術分別檢測細胞體積、細胞大小與內部結構和細胞內的顆粒性、核分葉性，其集三種物理學檢測技術于一體，在細胞處于自然原始的狀態下對其進行多參數分析。LH750儀首先在標本中加入溶血劑直接破裂并溶解紅細胞；緊接著加入白細胞穩定劑來中和后紅細胞溶解劑的作用，使白細胞表面、胞漿及細胞體積保持不變。然后應用鞘流技術將細胞推進到流動細胞計數池（Flowcell）中，接受儀器VCS三種技術的檢測：V、C、S三種探針，在位于流式通道的某一位置，對通過的單列白細胞進行逐個的、同時的、三重的檢測，速度快、精密度高、穩定性好，能快速準確對臨床上大量的血常規標本進行檢測。與手工鏡檢法相比，黃疸、血脂等因素會直接干擾LH750儀以VCS為原理的分類計數分析，導致白細胞分類計數結果出現異常[3-4]。

高膽紅素標本可干擾LH750儀的白細胞分類計數，有學者研究表明，這是因為患者所服用藥物或者因疾病所致的自身生理變化可能會使細胞表面所帶電荷發生變化，影響了計數過程中白細胞穩定劑所起的作用，阻止了白細胞從腫脹狀態快速恢復到原正常形態，發生變化的細胞形態與體積導致儀器無法正確判斷，表現為白細胞分布散點圖異常，出現Imm.NE1、Imm.NE2及NRBC等假陽性報警[5]。另外，LH750儀在細胞分類計數過程中，血漿成分中存在的高膽紅素會對一部分的紅細胞溶血劑進行吸收，導致剩余不足量的溶血劑無法將紅細胞完全溶解，紅細胞或紅細胞碎片存在殘留[6]。原理上LH750儀是根據細胞大小和細胞結構對細胞進行分類和計數，因此在測定中儀器會誤將這些殘余紅細胞或紅細胞碎片劃分為白細胞或其他異常細胞，導致結果失常，無法分類。這可以解釋在實驗過程中出現的黃疸標本白細胞總數與XN-1000儀相比增高的情況。總膽紅素顯著上升的標本中，留意明顯異常的白細胞分布散點圖：當總膽紅素>200 μmol/L時，在白細胞分類散點圖左下方的紅色干擾散點區域范圍擴大，數量增多。在臨床檢驗上對于黃疸標本無法計數的問題，有文獻顯示，一種方法是通過洗滌血細胞后重新進行檢測的方式（樣本經1 500 r/min離心 5 min，吸取上層血漿，并補充同等量的生理鹽水）[7]；第二種方法是將標本置于不同檢測原理的血細胞分析儀上檢測，得出較可靠結果。本實驗在第二方法的前提下加以改進，以XN-1000儀結果為基準，標本通過生理鹽水等量稀釋后在LH750儀上檢測，解決白細胞無法分類計數的問題。

本實驗主要思路是用生理鹽水按1∶1比例稀釋高膽紅素標本，來減少高膽紅素對LH750儀進行白細胞分類計數的干擾，初步探討等量稀釋法能否解決黃疸標本引起的LH750儀白細胞無法分類的問題。本實驗中對選取的28例高膽紅素標本，分別將500 μL的血液直接與等量生理鹽水混勻后于LH750儀檢測，可發現與原來無法分類白細胞相比，LH750儀可直接分類計數稀釋后的黃疸標本，得出白細胞五分類結果，白細胞直方圖、散點圖圖像正常，白細胞散點圖左下方干擾散點明顯減少，同時通過比較分析得出此白細胞五分類百分比結果與原血液標本在XN-1000儀檢測結果并無顯著差異。本實驗表明，高濃度的膽紅素可對以VCS為原理的LH750血細胞分析儀檢測過程產生干擾，影響血細胞分析儀對各類血細胞的分類判斷，導致分類結果異常，最終儀器提示白細胞無法分類，所以將高膽紅素血液標本用生理鹽水對倍稀釋，降低高膽紅素濃度對作用于血細胞的紅細胞溶血劑和白細胞穩定劑的影響，同時還可減少一定濃度的膽紅素產生的顏色干擾，實為一種方便可行的消除影響的方法[8]。

在臨床檢驗中也發現，對于生化結果TBIL>34.2 μmol/L的黃疸標本，LH750儀可對部分標本進行準確的白細胞分類，甚至一些標本TBIL>200 μmol/L，也可得到血常規白細胞分類結果。猜測有可能黃疸只是其中一個次要因素，主要因素可能是標本血漿內其他某個因素導致的或者綜合因素導致的結果，而等量稀釋后可以降低這個影響。

將LH750儀所檢測的上述20例標本白細胞五分類結果與對照儀器XN-1000比較（r2值），二者在Baso的分類結果相關性欠佳（r2<0.5）。出現上述現象的主要原因可能與被測標本外周血中Baso數量少（正常范圍0～1%），且LH750儀結果有效數字為0.1，故而在結果的表示上及后續計算中存在較大概論的隨機誤差。一些研究結果表明，采用相對偏差（%）或者相關系數（r），通過嗜堿性粒細胞的計數結果來比較分析兩儀器的分類情況可比性，出現相對較大的相對偏差、較差的相關性[9-12]。故僅通過計算相對偏差、相關系數來進行評價不同儀器分類結果可比性也并不合適[13]。

本實驗數據少，標本只選取了兩個月內符合要求的28例標本，此結論有待進一步擴大樣本數據范圍再進行更深入的討論。本實驗將稀釋后的標本在LH750儀測得的結果與原標本在XN-1000儀所測結果比較來判斷稀釋后的血常規結果可靠性，但更為可靠的是執行金標準[14，15]：將白細胞不分類的高膽紅素標本進行手工鏡檢，嚴格執行白細胞異常分類的復檢標準所得的，進而判斷鹽水稀釋的白細胞分類結果是否準確，有待進一步的實驗研究。

綜上所述，LH750儀對非黃疸患者全血的白細胞分類結果準確，但當標本本身出現黃疸時，用LH750儀所得結果有時會出現無法分類的情況，因此，LH750儀白細胞分類也只能對大多數標本進行一個快速準確的血常規檢驗，當出現其他異常細胞，白細胞直方圖、散點圖異常，白細胞不分類的特殊標本情況時，應進行手工鏡檢，并結合臨床診斷情況，以免漏診、誤診。

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（收稿日期：2018-02-26）