氮化硅過濾膜用于循環腫瘤細胞捕獲與釋放的試驗研究

汪德培，陳建鋒，李 歡，趙 鋼，何曉東，褚家如

(1.中國科學技術大學 精密機械與精密儀器系，安徽 合肥 230027；2.中國科學技術大學附屬第一醫院，安徽 合肥 230001)

循環腫瘤細胞(Circulating Tumor Cells, CTCs)是指從原發腫瘤擴散進入外周循環血液系統中的腫瘤細胞，CTCs的檢測對于癌癥的診斷和治療具有重要意義[1]，但由于其數量極其稀少，10 mL血液中CTCs的數目僅為1～10個，因此在臨床上必須從腫瘤血液樣品中分選出CTCs。目前，CTCs分選方法主要有基于物理性質和基于化學性質兩大類[2]，其中，基于物理性質的過濾法利用癌細胞與正常體細胞物理大小和變形能力的區別來實現分選，這種方法因具有操作簡單、捕獲效率高和成本低等特點而受到廣泛關注。

目前，很多物理過濾法能夠實現CTCs的高效捕獲[3-5]，但卻無法將捕獲到的CTCs從過濾芯片中釋放出來，以用于進一步研究，或者釋放流程復雜、成本高，這主要是由于CTCs細胞膜表面的蛋白質與過濾芯片材料表面產生了較強的粘附力。影響這種粘附力的因素主要有材料的表面形貌、親疏水性、表面基團及電負性等[6]。本文使用的氮化硅過濾膜與CTCs之間也存在這種粘附力，從而導致癌細胞難以取出，且污染過濾膜。

Y. J. Kim[7]等通過在過濾膜表面涂覆poly(ethylene glycol) (PEG)，大大提高了過濾膜表面的親水性，從而減弱了細胞與過濾膜之間的粘附力，提高了癌細胞釋放效率。Zheng A.[8]等通過在過濾膜表面涂覆一層熱敏性水凝膠poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)，其最低臨界相變溫度為32 ℃，當環境溫度高于此溫度時，過濾膜表面疏水，易于粘附癌細胞；若低于此溫度，水凝膠結構發生變化導致過濾膜表面由疏水轉為親水，從而減弱了癌細胞與表面的粘附力，提高了釋放效率。目前，這些釋放方法工藝流程復雜、操作繁瑣、成本相對較高，且不通用。由于本文使用的是超薄氮化硅柵形孔過濾膜，材料特殊且強度較弱，上述方法均不適用。

本文利用微納加工技術加工出柵形孔氮化硅過濾膜，并用聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片和亞克力板封裝成過濾裝置，利用物理過濾實現了癌細胞的高效捕獲。通過在過濾樣品和反向沖擊液中加入適量濃度的抗凝劑肝素，大大降低了癌細胞與過濾膜之間的粘附力，顯著提高了癌細胞從過濾膜上的釋放效率，而且釋放出來的癌細胞具有活性。這樣既保證了釋放出的癌細胞可用于進一步研究，又能滿足了過濾膜可重復利用的要求。

1 過濾裝置的設計與加工

1.1 過濾膜的設計與加工

本文在前期研究中[9]，設計了一種柵形孔型結構，經過計算分析可知，在孔隙率和壓差相同的情況下，柵形孔的通量是圓形孔的接近2倍。而高通量是臨床上分選CTCs的一個重要指標，因此柵形孔結構具有明顯優勢。

在此基礎上，本文采用如圖1所示的微納加工工藝來加工過濾膜。硅片經過化學氣相沉積、光刻、反應離子刻蝕、深硅刻蝕和濕法刻蝕等流程形成柵形孔過濾膜。過濾膜的材料為氮化硅，它是微機電系統(MEMS)技術中的一種重要材料，具有較好的化學穩定性、硬度和光學特性[10-11]。

圖1 過濾膜工藝流程圖

加工完畢的過濾膜如圖2所示。尺寸為20 mm×20 mm，中間柵形孔區域尺寸為6 mm×6 mm，厚度為500 nm，柵形孔的長為100 μm，寬度有5、6、7和8 μm等4種。

圖2 柵形孔氮化硅過濾膜

1.2 微流控芯片的封裝

本文采用購買自道康寧公司、型號為DC184的聚二甲基硅氧烷(PDMS)來加工微流道。PDMS是一種常見的熱塑性彈性體,其具有如下優點：1)穩定的物理和化學性質，良好的力學性能，易于加工，可多次使用；2)良好的光學性能，透光性好，可實時觀察；3)生物兼容性好，可用于細胞培養。

微流道的加工采用常用的復制壓模法，具體流程如下：1)將PDMS和固化劑按10∶1的質量比配制成預聚物，并攪拌均勻；2)利用真空干燥箱除去氣泡；3)將預聚物澆鑄到已加工好的模具上，在65 ℃熱板上加熱2 h；4)將固化好的PDMS芯片揭下，即可形成一個與模具圖案相反的流道腔體，將氮化硅過濾膜嵌入PDMS芯片中的腔體中，上下PDMS通過自然粘附力實現初步密封，然后利用上下亞克力板通過銅柱固定，保證過濾裝置的密封性。裝配好的過濾裝置如圖3所示。

與≥18歲~30歲者比較,p<0.05;與31歲~40歲者比較,p<0.05;與>41歲~50歲者比較,p<0.05;與>50歲者比較,p<0.05;與小學及以下文化程度比較,p<0.05;與無獻血史者比較,p<0.05;3討論

圖3 過濾裝置

2 癌細胞的捕獲與釋放

2.1 試驗樣品、參數和方法

本文采用MDA-MB-231乳腺癌細胞來進行試驗。首先通過胰蛋白酶消化培養皿中的癌細胞，使其懸浮；細胞懸浮液經離心后，吸走上層液體，加入適量培養基于細胞沉淀物中形成細胞懸浮液；吸取1 μL懸浮液于載玻片上并用熒光顯微鏡進行計數，細胞濃度約為1 500～2 000個/μL；取2 μL細胞懸浮液于2 mL磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，即形成過濾樣品。

本文在前期研究和試驗的基礎上，選擇柵形孔寬度為7 μm的過濾膜，流速為0.2 mL/min來進行過濾試驗。過濾時通過注射泵推動注射器完成，每次先過濾2 mL混合均勻的癌細胞懸浮液樣品，然后再用1 mL PBS進行過濾清洗，結束后，將過濾膜取出放在倒置熒光顯微鏡下觀察。反向沖擊釋放癌細胞時，直接將過濾裝置倒置，從反方向用2 mL PBS沖擊，用培養皿收集沖擊出來的癌細胞。

2.2 癌細胞的捕獲與反向沖擊釋放

在上述試驗參數和方法下進行癌細胞的過濾試驗，過濾膜捕獲了癌細胞后的熒光視場圖如圖4a所示；過濾膜在經過簡單的反向沖擊釋放后的熒光視場圖如圖4b。

圖4 釋放前、后過濾膜上的癌細胞熒光視場圖

2.3 捕獲與釋放結果分析

經過多次反復試驗，并統計過濾樣品中和過濾膜上捕獲的癌細胞，計算得柵形孔氮化硅過濾膜的捕獲效率能達到85%。

對比圖4a和圖4b可以發現，將捕獲了大量癌細胞的過濾膜利用PBS進行簡單的反向沖擊后，仍有大量癌細胞殘留在過濾膜上，經統計，釋放效率只有約35%，大量殘留的癌細胞會堵塞過濾膜上的柵形孔，導致過濾膜無法重復利用。

較低的釋放效率主要是由于癌細胞細胞膜上的蛋白質與氮化硅過濾膜之間的粘附力導致的。研究表明，這種粘附力主要受如下因素影響。

1)材料表面的親疏水性。一般細胞膜具有一定的親水性，親水性的材料表面更易與細胞產生粘附，但親水性極強的材料表面反而不易與細胞產生粘附。

2)材料表面的電負性。一般情況下，哺乳動物細胞膜表面帶有一定的負電荷。一般認為，帶正電荷的材料表面由于靜電吸附易產生粘附，帶負電荷的材料表面由于靜電排斥而不易產生粘附。

因此，要提高被捕獲癌細胞的釋放效率，應降低癌細胞與過濾膜之間的粘附力。其可以通過采用特定親疏水性的材料、使材料表面帶負電、使材料表面盡量光滑等途徑來實現。

3 肝素對癌細胞釋放效率的影響

3.1 試驗材料與方法

肝素是一種常用的抗凝劑，是由2種多糖交替連接而成的多聚體，具有帶強負電荷的理化特性，能干擾血凝過程的許多環節，在體內外都有抗凝血作用。研究發現，肝素能在一定程度上抑制細胞粘附分子的表達，從而降低細胞的粘附力[12]。

過濾前，將過濾膜在肝素溶液中浸泡2 h，過濾樣品為加入癌細胞和一定濃度的肝素溶液的PBS；試驗時，首先過濾2 mL過濾樣品，再用1 mL PBS沖擊；釋放時，將過濾裝置倒置，用肝素濃度相等的2 mL PBS反向沖擊。

3.2 肝素對癌細胞釋放效率的影響

本文在過濾樣品及反向沖擊液中加入等量相同濃度的肝素，在過濾和釋放后，分別用顯微鏡進行觀察，效果如圖5所示。

圖5 釋放前、后過濾膜上的癌細胞明場圖

對比圖5a和圖5b發現，通過加入肝素，釋放效率明顯提升，釋放后過濾膜上殘余的癌細胞很少，可重復使用。

本文繼續研究了不同肝素濃度對癌細胞釋放效率的影響，分別用10、20、30、40 和50 μg/mL等5種濃度的肝素進行過濾和釋放，各種肝素濃度下的釋放效率如圖6所示。

圖6 肝素濃度對癌細胞釋放效率的影響

由圖6可知，未使用肝素時，癌細胞的釋放效率約為30%；使用了肝素后，釋放效率均在80%以上，釋放效率大大提高，并且當肝素濃度為30 μg/mL時，釋放效率最高，達到90%以上。

因此，通過加入肝素，可以降低癌細胞與氮化硅過濾膜表面之間的粘附力，提高癌細胞釋放效率和過濾膜可重復利用性，并且在肝素濃度為30 μg/mL時效果最佳。

3.3 肝素對癌細胞活性的影響

通過在過濾樣品和反向沖擊液中加入適量濃度的肝素，實現了被捕獲癌細胞的高效釋放，但應保證釋放出來的癌細胞具有活性，可用于后續的試驗研究。

本文通過離心管收集反向沖擊釋放出來的癌細胞，采用3 000 r/min的轉速離心5 min后，吸去上層清液，加入培養基后利用LIVE/DEAD染色試劑染色30 min，然后在熒光顯微鏡下觀察，效果如圖7所示。

圖7 肝素對癌細胞活性的影響

圖7中箭頭所指向的熒光為死細胞，其他熒光為活細胞，經統計多個視野中的死、活癌細胞數目，計算得癌細胞的存活率為98%，說明在樣品中加入肝素對癌細胞的活性幾乎沒有影響。

4 結語

本文利用微納加工技術，加工出了柵形孔氮化硅過濾膜，實現了癌細胞的高效捕獲。為了進一步將捕獲的癌細胞取出用于后續試驗，在分析了癌細胞與過濾膜之間粘附現象的影響因素之后，通過在過濾樣品和反向沖擊液中加入肝素，明顯降低了癌細胞與過濾膜之間的粘附力，顯著提高了癌細胞的釋放效率和過濾膜的可重復利用性；同時釋放出來的癌細胞具有活性。該方法具有操作方便、成本低和通用性強等特點，在臨床上具有潛在應用價值。