熊果苷透皮組合配方的優化

薛榆潔 胡歆瀅 張 慧 何逸昉 童鶴艷 許 可

（1.溫州醫科大學藥學院，浙江 溫州 325000；2.溫州大學生命科學研究院，浙江 溫州 325000）

熊果苷又名熊果素，化學名是4-羥基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，是一種源于杜鵑花科熊果屬植物-熊果的葉子中分離的一種苷類化合物。隨著國外越來越多的專利到期，過去只能在高檔護膚品中才能用的熊果苷也越來越普及。熊果苷有2個化學結構式：α-熊果苷和β-熊果苷，葡糖殘基和酚基是熊果苷的兩個重要功能基團，其中酚基對酪氨酸酶（人體合成黑色素關鍵酶）具有很強的抑制作用，此外熊果苷屬于氫醌葡萄糖苷類化合物，作為護膚品美白添加劑，其在一定條件下，分子中的葡萄糖分子與氫醌之間形成的類糖苷鍵具有斷裂的可能性。然而國內對熊果苷性質的基礎理論研究較少，導致護膚品行業中添加熊果苷缺少相關理論依據，并且近年來人們對護膚品中熊果苷的毒性以及副作用也提出了質疑，因此加強對熊果苷理化性質研究具有重要的意義。本課題通過研究不同產地及構型熊果苷美白及安全性，滲透劑組合對熊果苷經皮滲透的影響以及護膚品基礎條件如pH值、氧氣等對熊果苷穩定性的影響，篩選出熊果苷用于護膚品的最優組合或配方。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀（安捷倫，美國），多功能酶標儀（MD，美國），正置熒光顯微鏡（尼康，日本），YB-P6 智能透皮試驗儀（天津藥典標準儀器廠），電熱恒溫培養箱（上海森信實驗儀器有限公司），細胞超凈臺（蘇潔凈化設備公司）。

1.2 試劑

α-熊果苷（荷蘭皇家帝斯曼集團），α-熊果苷及β-熊果苷（西安奧賽生物），B16黑色素細胞（上海中喬新舟），酪氨酸及酪氨酸酶（上海阿拉丁生物有限公司），CCK-8（碧云天生物有限公司），PBS磷酸緩沖液（自配），甲醇（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司），水溶性氮酮（西安奧賽生物），甘油（上海麥克林生化科技有限公司）。

1.3 動物

小鼠，雄性，體重（20±2）g，購于南京大學模式動物研究所。

1.4 酶標儀檢測酪氨酸酶活性

體外酪氨酸酶活性檢測：按順序依次加入磷酸鹽緩沖液1mL、樣品溶液（熊果苷或熊果苷+影響因素）0.5mL、酪氨酸溶液2.5mL，于37℃水浴10min。然后加入酪氨酸酶液1mL，混勻，再37℃孵育30min，迅速轉移至比色皿中，在475nm處測定吸光度。

細胞酪氨酸酶活性檢測：細胞培養48 h后棄上清液，每孔加入含1%TritonX-100的PBS緩沖液90μL，加入10μL 1mg/mL的左旋多巴（L-DOPA），37℃孵育60min后，用酶標儀檢測475nm下各孔的OD值。計算細胞內酪氨酸酶的活性。酪氨酸酶活性=（試驗孔OD475nm-空白孔OD475nm）/（對照孔OD475nm-空白孔OD475nm）。

1.5 熊果苷經皮滲透試驗

將小鼠斷頸處死后，用電動剃須刀剌干凈腹部的毛，用手術剪小必剪取腹部的皮膚，剔除表皮下的脂肪和粘連物，用生理鹽水反復清洗干凈，置在生理鹽水中，保存在冰箱里備用（在一周之內使用），實驗前自然解凍小鼠皮，并用生理鹽水反復清洗干凈。采用改良的Franz擴散池法，利用智能透皮試驗儀，將離體鼠皮平固定于擴散池和接收池么間，并使角質層面向供給擴散池。擴散池加入熊果苷或熊果苷+基礎原料等，接收池中加入PBS緩沖液，加入過程中保證氣泡排出，并加入磁力攪拌子，恒溫水浴在37℃，實驗開始于3h取樣1mL，0.22μm微孔過濾后，HPLC檢測。

1.6 熊果苷穩定性實驗

將熊果苷組或熊果+不同基礎環境組（不同pH值組，含氧及不含氧組）置于50℃恒溫培養箱當中，放置1個月以上（高溫加速試驗）。然后取出樣品，觀察顏色變化。

1.7 統計學處理

數據采用Origin8.0軟件進行統計學分析，兩組間數據比較采用t檢驗，P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 體外水平研究不同來源及構型熊果苷對酪氨酸酶活性抑制情況

本研究分別選取荷蘭帝斯曼的α-熊果苷（1kg/1萬），國產α-熊果苷和β-熊果苷來研究不同原料產地以及構型對黑色素生成的關鍵酶-酪氨酸酶活性的影響。體外研究發現，熊果苷能有效抑制酪氨酸酶的活性，其中進口α-熊果苷對酪氨酸酶活性抑制率高于國產α-熊果苷和β-熊果苷。接下來，我們考察了部分護膚品基質原料對熊果苷酪氨酸酶抑制活性的影響，從圖1（b）我們可以發現，甘油、聚乙烯醇及水溶性氮酮對α-熊果苷酪氨酸酶抑制活性影響不大，而煙酰胺和山梨酸鉀促進了熊果苷酪氨酸酶抑制效率。這些研究表明，進口α-熊果苷具有更好的酪氨酸酶抑制活性，同時一般護膚品基質如滲透劑、防腐劑、保濕劑等對熊果苷酪氨酸抑制活性影響較小。

2.2 細胞水平研究不同產地、構型熊果苷對黑色素細胞B 1 6活性及酪氨酸酶活性抑制情況

從體外水平我們發現進口α-熊果苷酪氨酸酶抑制效果更好，為驗證不同產地熊果苷的潛在毒性，本研究選擇不同濃度α-熊果苷去處理B16細胞，CCK-8結果顯示隨著熊果苷濃度升高，熊果苷毒性逐漸增強，表明熊果苷在一定濃度范圍毒性可控，此外相同濃度下進口α-熊果苷毒性明顯低于國產α-熊果苷（如圖2（a）所示）。光鏡圖也顯示相同濃度下進口α-熊果苷比國產于α-熊果苷毒性更小，B16細胞數目更多，細胞飽滿度更好（如圖2（b）所示）。

接下來我們在細胞水平進一步驗證國產α-熊果苷及β-熊果苷對細胞酪氨酸酶抑制活性。在考慮細胞毒性情況下，研究α/β-熊果苷對細胞酪氨酸酶活性抑制情況，同樣發現熊果苷能抑制B16細胞酪氨酸酶活性，與體外結果不同的是，α-熊果苷抑制效率更優于β-熊果苷（如圖3所示）。結合上述體內和細胞研究，我們可以得出，α-熊果苷具有更好的酪氨酸酶抑制活性，同時進口α-熊果苷安全性能更好。因此接下來我們選取進口α-熊果苷進行深入的研究。

2.3 熊果苷經皮滲透的研究

幾乎所有分子透過表皮的量都是微量級的，所以護膚品中常常添加一些透皮促進劑如氮酮等，此外發現一些多元醇類也能促進藥物吸收，本研究初步考察了水溶性氮酮和甘油單獨或聯合使用對熊果苷經皮滲透的影響。α-熊果苷高效液相條件摸索：色譜柱Syncronis? C18柱，4.6mm×150mm，ID=5μm；流動相∶水∶甲醇 =80∶ 20（v/v）；流速：0.5mL?min-1；檢測波長為280nm；進樣量為10μL。熊果苷HPLC高效液相如圖4所示。

我們接下來選取了護膚品常用化學促滲透劑-氮酮以及保濕劑-甘油，來研究二者對熊果苷經皮滲透的影響（如圖5（a）所示）。研究發現，隨著甘油添加量逐漸升高，熊果苷滲透率也逐漸增高，而氮酮+甘油則能顯著促進熊果苷經皮滲透效果（如圖5（b）所示），說明二元促滲劑具有協同促熊果苷的經皮滲透。此外，不少護膚品公司選取更加溫和的試劑來替代氮酮，例如戊二醇和己二醇等，這值得我們繼續深入地研究復合多元醇的滲透性能。

圖1 不同產地、構型熊果苷及基礎原料加熊果苷對酪氨酸酶活性的影響

圖2 熊果苷對B16黑色素細胞生長的影響

2.4 護膚品基質環境對熊果苷穩定的影響

熊果苷由于分子間的葡萄糖分子與氫醌之間形成的類糖苷鍵容易受到氧氣、光照、pH值等影響而發生斷裂，而發生變色。筆者了解到不少護膚品公司相關熊果苷產品在保存半年左右就出現了變色問題，這極大地影響了產品的銷售。因此本項目初步考察了不同pH值（5，6和7，pH4對皮膚傷害太大故舍棄）以及氧氣對熊果苷穩定的影響，研究發現在高溫加速條件下（相當于常溫12個月），pH7熊果苷溶液（1%）變色顏色最深，而pH5顏色最淺（如圖6（a）所示）；通過添加亞硫酸氫鈉來去除氧氣的影響，發現添加亞硫酸氫鈉后，熊果苷溶液（1%，pH6）顏色透明澄清，而未添加亞硫酸氫鈉熊果苷溶液（1%，pH6）組顏色變黃（如圖6（b）所示）。這些實驗證明熊果苷的類糖苷鍵在弱酸環境下比較穩定，同時在體系中添加亞硫酸氫鈉去除氧氣同樣能有效保持熊果苷的澄清透明。接下來我們將繼續研究護膚品添加劑對熊果苷穩定性的影響。

圖3 熊果苷對B16黑色素細胞黑色素酶抑制的影響

圖4 熊果苷高效液相色譜圖

圖5 熊果苷高效液相色譜圖

圖6 護膚品基礎環境對熊果苷穩定性的影響

結論

熊果苷目前作為高端護膚品中美白添加劑，目前在面膜、精華液中應用越來越廣，國外對熊果苷的相關研究較早，而我國對熊果苷用于護膚品的研究則相對有限，很多護膚品公司在添加熊果苷時候，對α和β-熊果苷基礎環境未做深入研究。本研究初步比較了不同品牌和構型的熊果苷美白抑制效果和細胞毒性，同時研究了目前護膚品中常用促滲透劑對熊果苷經皮滲透的影響，最后研究了護膚品基礎條件對熊果苷穩定的影響。然而本研究還有許多地方研究的不深入，例如目前多元促滲透劑能否進一步促進熊果苷經皮吸收，熊果苷在最優保存條件下是或還會產生微量的對苯二酚，這都需要我們進一步關注。