PRMT7與HSPA5相互作用促進肺癌轉移的研究

程德志，徐朝娜，張 翔，鄭亮承，張信波，謝德耀

0 引言

蛋白質精氨酸甲基轉移酶(PRMTs)將供體S-腺苷甲硫氨酸上的甲基轉移到精氨酸殘基胍側鏈的末端氮原子上，即完成精氨酸的甲基化修飾[1]。目前已經鑒定出11種PRMTs家族成員，其中PRMT7涉及到很多細胞生理過程，如DNA轉錄、RNA拼接、DNA損傷修復和轉移。PRMT7可以通過甲基化組蛋白H2AR3和H4R3來調節細胞對DNA損傷的反應[2]。已有證據證明，PRMT7與乳腺癌有關。然而，關于PRMT7與肺癌之間的確切關系的信息少之又少。鑒于PRMT7涉及多種生理過程，我們必須清楚地了解其細胞基質及其在肺癌中的作用。為了研究PRMT7在肺癌中的潛在作用，本研究進行了基于免疫共沉淀和質譜分析的蛋白質篩選。經過一系列綜合分析，得到5個候選基因，其表達與所有其他基因不同，可能是肺癌的潛在轉移介導基因。通過進一步分析，證明PRMT7在肺癌轉移中起著關鍵作用，而HSPA5是其中的重要底物。

1 材料與方法

1.1 PRMT7過表達對腫瘤細胞侵襲和生長的影響

1.1.1 細胞活性檢測(CCK8法) 取對數生長期的細胞，消化收集各組細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用新鮮的完全培養基重懸各組細胞；分別對細胞進行計數后，調整細胞密度為5×104cells/ml。100 μl/孔，鋪96孔板；每組細胞鋪板4*6孔；鋪板0、24、48、72 h。CCK8檢測：每個時間點，每組細胞各取6孔，加入10 μl CCK8反應液，3 h后酶標儀檢測450 nm和620 nm吸光度。

1.1.2 細胞侵襲實驗 Matrigel鋪膠；將配置好的膠液，取30 μl加入小室內，均勻平鋪，進行膜包被，先在4 ℃冰箱平衡1 h左右，37 ℃培養箱中放置30 min以上，使膠凝固備用；收集細胞，調整細胞數開始試驗，經膜潤濕、小室細胞培養染色、固定、染色、水洗等過程后，顯微鏡拍照。

1.2 PRMT7過表達細胞免疫共沉淀實驗及質譜分析 在A549、SPC-A1和MDA-MB-231細胞系中用PRMT7抗體質譜分析IP樣品[3]，并進行免疫共沉淀實驗(Co-IP)[4]。經SDS-PAGE凝膠電泳及考馬斯亮藍染色，對不同的質譜帶進行染色，從而得到結果。從質譜分析的結果中，選擇幾種與PRMT7高度相關的蛋白質進行進一步的免疫共沉淀驗證。

1.3 微陣列數據分析與網絡交互研究 Gene Expression Omnibus的基因表達數據庫(序號GSE43580)用于lncRNA分析[3]。篩選與肺癌有關的數據并對其進行處理。在該過程中，混合信號被轉換成表達式信號。對150個樣品使用Affymetrix human U133 plus.2.0芯片。通過微陣列數據分析，確定了肺癌中PRMT7以及相關的lncRNA的表達。然后進行質譜數據分析，確定PRMT7相關的蛋白質。

2 結果

2.1 PRMT7在肺癌細胞中上調 為了探究PRMT7的基本表達水平，我們以人類蛋白質ATLAS公共資源為根據，分析了位于人體各類癌細胞系和正常組織的PRMT7的RNA-Seq數據庫。數據記錄的是每百萬轉錄本的平均值(TPM)，并按組織類型歸類。結果表明，PRMT7可以在正常組織中表達，如輸卵管、肺、乳房、結腸和直腸。采用GENT數據庫中的數據制成圖1A、圖1B。PRMT7在所有癌癥組織和健康組織中的表達水平如圖1A所示。PRMT7在肺癌中的表達低于正常肺組織，差異有統計學意義(圖1B)。圖1C顯示了不同分子量小干擾RNA在細胞系中的作用，確定了蛋白水平和RNA水平降低了80%。肺癌細胞A549和SCLC-21H將PRMT7的TPM提高到30以上。PRMT7水平升高表明PRMT7可能會在肺癌中發揮作用。

2.2 PRMT7過表達對腫瘤細胞侵襲和生長的影響 為進一步研究PRMT7在肺癌中的作用，我們進行了一系列功能測定。以A549和SPC-A-1肺癌細胞為模型。細胞侵襲24 h后，實驗中各組基質膠上細胞密度如圖2A所示。結果顯示，與對照組相比，肺癌細胞A549和SPC-A-1經過PRMT7過表達后，其侵襲能力增強(侵襲細胞數顯著增加)。

因此，PRMT7的過表達影響了肺癌細胞A549和SPC-A-1的侵襲，PRMT7可能參與了肺癌的轉移(Blank：轉染的腫瘤細胞；shControl：PRMT7-siRNA 質粒和PRMT7過表達質粒共轉染的腫瘤細胞；PRMT7：PRMT7過表達質粒轉染的腫瘤細胞)。

對上述細胞(A549,SPC-A-1)進行細胞克隆形成研究結果顯示，PRMT7的過表達對腫瘤細胞的克隆形成沒有顯著影響(Blank：轉染載體質粒的空白對照組；shControl：PRMT7過表達質粒和PRMT7-siRNA干擾質粒共轉染的陰性對照組；PRMT7：轉染PRMT7過表達質粒的實驗組，如圖2B、2C所示)。PRMT7的過表達不能在很大程度上影響細胞增殖。這2種細胞系的集落形成能力也沒有顯著的變化。此外，在PRMT7過表達的影響下，在A549細胞中，細胞集落形成能力得到輕微增強，但無明顯差異，表明PRMT7主要影響肺癌的轉移。

圖1 PRMT7提高肺癌細胞侵襲的能力

2.3 與PRMT7相互作用的新型蛋白質的鑒定 在A549和SPC-A-1細胞上進行PRMT7免疫共沉淀檢測，銀染色結果如圖3A所示。A549細胞的分析顯示，有4個不同的條帶，分別位于250、120、90、80 kD附近。此外，SPC-A-1細胞有5個不同的條帶，分別位于200、120、110、90、65 kD附近。為進一步證明結果，應用質譜分析法確定條帶中的物質。根據質量和分數，獲得了初始的79個候選蛋白質。采用KEGG通路分析、基因本體分析(GO)、蛋白質結合和轉錄因子分析對79個候選蛋白進行系統分析之后，我們得到了由A549和SPC-A-1共享的19個基因。最終選取5個基因，包括HSPA5、EEF2、PKM2、DLAT和XRCC6。功能分析中選擇HSPA5基因，結果表明，不僅PRMT7的表達水平受到HSPA5的影響，PRMT7增強細胞入侵的能力也受到該基因的影響(圖3C)。

2.4 HSPA5參與PRMT7誘導的肺癌轉移 在進行Affymetrix人類陣列后，mRNA和lncRNA得到重新注釋。被注釋的mRNA中，150個樣品中每一個都獲得平均信號值。信號值小于標準閾值7的樣本被濾除。共選擇101個mRNA，其信號值大多接近PRMT7平均信號值。對所選的101個mRNA進行了通路分析和GO分析。選定的mRNA和lncRNA的共表達網絡也得以形成(圖4A)，選擇其中與PRMT7高度相關的lncRNA進行進一步分析。在圖4B中，給出了7種與PRMT7共表達的lncRNA，其相關性最高。通過基于U133 Plus2基因注釋的RMA歸化，獲得150個樣本的矩陣數據。RMA歸化的信號值是重新調整的log2。基因注釋包含基因描述，比如基因名稱、染色體、基因開始和結束位置等。GSE43580數據集中，一共有6 278個lncRNA，39 574個封閉的mRNA，其中796個lncRNA具有非蛋白編碼RNA。DAVID軟件包用于在選定的101個mRNA上做GSEA[5]。Fisher精確檢驗用于揭示重要意義的分析中。

圖2 PRMT7過表達對肺癌細胞侵襲和生長的影響

圖3 HSPA5與PRMT7誘導的肺癌轉移和侵襲有關

3 討論

精氨酸的單甲基化修飾和二甲基化修飾反應是在哺乳動物中發現的，分別為：ω-ng-單甲基精氨酸(MMA)、ω-ng-ng-非對稱型二甲基精氨酸(ADMA)、ω-ng-ng′-對稱型二甲基精氨酸(SDMA)。PRMTs所產生的甲基精氨酸可分為3類：Ⅰ類，PRMT催化非對稱型二甲基化；Ⅱ類，PRMT催化對稱型的二甲基化；Ⅲ類，PRMT催化單甲基化。PRMT7是唯一同時具有Ⅱ類型和Ⅲ類型活動的基因[1]。

在不同的基質中甲基化精氨酸殘基時，PRMT7涉及很多細胞生理過程，如DNA轉錄、RNA拼接、DNA損傷修復和轉移。PRMT7可以通過甲基化組蛋白H2AR3和H4R3來調節細胞對DNA損傷的反應[2]。此外，還發現H3R2的PRMT7甲基化與轉錄有關[6]。通過分析胚胎干細胞和生殖細胞的核蛋白證實了PRMT7可以影響多能性。通過上調H4R3甲基化水平，使PRMT7壓制miR-24-3p的轉錄，靶向主要多能因素的3′utr[7-8]。除了與組蛋白接觸，PRMT7是snRNP組合所必需的，而這是剪接體的主要組成部分[9]。已有研究表明，PRMT7與癌基因CTCFL相互作用[9]。最近研究表明，PRMT7可以通過調節DNMT3b/p21軸來保持肌肉干細胞的再生能力[10]。此外，PRMT7可能與治療學相關。南懷仁等[11]觀察到下調PRMT7能夠使HeLa細胞對TOP1抑制劑喜樹堿更加敏感。在乳腺癌的基因集富集分析(GSEA)中發現PRMT7是潛在的轉移基因之一。由于上皮細胞向間質細胞轉化，PRMT7促進乳腺癌轉移[12-13]。

PRMT7是促進乳腺癌轉移的基因之一。本研究中發現，PRMT7的表達在肺癌中增加了3倍。PRMT7對肺癌細胞的侵襲能力明顯較其他細胞增強。然而，肺癌中PRMT7的超表達并沒有明顯影響增殖和結腸的形成能力。進一步證實了PRMT7與肺癌之間的關系，并證實PRMT7是一種與肺癌相關的侵襲基因。

為探索PRMT7在肺癌細胞中侵襲作用的機制，本研究進行了質譜分析和免疫共沉淀實驗，并通過對KEGG通路、GO、蛋白結合和轉錄因子等分析對其篩選。之后，選擇了PKM2、HSPA5、EEF2、DLAT和XRCC6。如已有文獻所記錄，PKM2和HSPA5都與癌癥侵襲有關。作為癌癥糖酵解的關鍵酶，PKM與許多癌癥有關。有報道，PKM2通過調節STAT3信號通路并影響肝門膽管癌的神經侵襲來促進結腸癌細胞遷移[14]。此外，降低PKM2可抑制肺腺癌的生長和侵襲[5]。因此，PRMT7伴侶蛋白是調節PRMT7誘導侵襲的一個關鍵因素。

圖4 mRNA-lncRNAs共表達網絡和lncRNA與PRMT7共表達

本研究應用蛋白質印跡分析檢測共沉淀產物，以明確與5種候選基因中的PRMT7存在相互作用的蛋白質。通過使用siRNA影響HSPA的表達后，發現PRMT7的表達和誘導細胞侵襲功能被明顯抑制。此外，由于缺乏臨床轉移樣本，本研究通過TCGA在線數據庫的150項腫瘤研究分析了HSPA的mRNA表達。分析表明，許多癌癥可以表達HSPA5，肺癌中HSPA5的RNA表達高于大多數其他癌癥。結果表明，HSPA5可能會增強PRMT7在肺癌細胞轉移中的活性。

本研究證實，HSPA5是一種與PRMT7相互作用的新型蛋白，并參與PRMT7誘導的侵襲。其可能通過與PRMT7結合而成為獨特的上游分子或其他信號通路的競爭者。HSPA5可以結合免疫球蛋白或78 kDa葡萄糖調節蛋白，是位于內質網中的HSP70分子伴侶，保持蛋白質處于適合隨后折疊和低聚的狀態。HSPA5含有2個功能域：結合并水解ATP的核苷酸結合結構域和結合多肽的底物結合結構域[15]。脫乙酰化的或抑制的HSPA5可以抑制乳腺癌的遷移和侵襲[16-17]。HSPA5中的FOXM1對結腸直腸癌細胞的侵襲和遷移有部分促進作用[18]。受HSPA5約束的PRMT7與肺癌的侵襲相關，證明了PRMT7的獨特作用，可以部分解釋肺癌轉移。PRMT7與HSPA5蛋白質相互作用的深入研究將為闡明PRMT7在肺癌細胞轉移中的作用機制奠定基礎。