新型納米脂質(zhì)體包載白藜蘆醇預(yù)防糖尿病心肌病心肌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

周開(kāi)珩

0 引言

糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy，DCM)作為糖尿病的一種嚴(yán)重的心血管并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制尚不明確[1]。研究顯示，糖尿病患者體內(nèi)持續(xù)性的高血糖癥能夠?qū)е滦募〖?xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)，引起脂質(zhì)代謝紊亂、胰島素抵抗及心肌細(xì)胞鈣離子調(diào)節(jié)異常，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，左心室收縮、舒張功能障礙，且沒(méi)有有效的防治方法[2]。

白藜蘆醇(Resveratrol，RSV)作為一類多酚類抗毒素，最早發(fā)現(xiàn)存在于葡萄皮及紅酒中。國(guó)外研究顯示，長(zhǎng)期給予白藜蘆醇能夠明顯增加糖尿病大鼠心肌抗氧化蛋白的表達(dá)，有效減少心肌的凋亡及梗死面積，從而保護(hù)糖尿病大鼠心臟[3-4]。同時(shí)，有報(bào)道，糖尿病大鼠口服白藜蘆醇2周后，心肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取及利用明顯增加[5]。另外，Zhang等[6]研究顯示，糖尿病大鼠口服白藜蘆醇20 mg/(kg·d)4周后，大鼠左心室收縮功能明顯提高。因此，白藜蘆醇作為一種安全、有效的天然化合物，可通過(guò)抗炎、抗感染、抗氧化應(yīng)激等發(fā)揮改善糖尿病心血管病的作用[7-9]。但是作為難溶性化合物，白藜蘆醇溶解度低(50 μg/ml)，且穩(wěn)定性差，高溫、強(qiáng)光、pH變化會(huì)導(dǎo)致其分解，因此，其在體應(yīng)用存在劑量低、無(wú)法滿足正常治療劑量及潛在安全性等問(wèn)題[10]。

納米脂質(zhì)體作為一種新型的藥物遞送載體，具有良好的生物相容性、減少包封藥物毒性、增加藥物穩(wěn)定性及濃度等性質(zhì)，已經(jīng)廣泛用于難溶性及不穩(wěn)定性藥物的遞送[11]。

目前國(guó)內(nèi)外沒(méi)有應(yīng)用納米脂質(zhì)體包載白藜蘆醇預(yù)防糖尿病心肌病的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。因此，本次研究采用新型的納米脂質(zhì)體包載白藜蘆醇，從而增加其溶解度及穩(wěn)定性，并以鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的1型糖尿病大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，應(yīng)用透射電鏡觀察、TUNEL凋亡染色結(jié)合Western blot技術(shù)，綜合考察包載白藜蘆醇納米脂質(zhì)體對(duì)于糖尿病心肌病心肌細(xì)胞凋亡的預(yù)防作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠60只，體重180～220 g，清潔級(jí)，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 儀器與試劑 白藜蘆醇(Sigma-Aldrich公司)，混合磷脂S75(德國(guó)Lipoid GmbH公司)，ATX Tris 緩沖液及油酸(Sigma-Aldrich公司)，戊巴比妥鈉(上海西唐生物科技有限公司)，鏈脲佐菌素STZ (Sigma-Aldrich公司)，TUNEL凋亡試劑盒(Roche Applied Science)，AKT蛋白、PAKT一抗(Cruz Biotechnology)，血糖試紙(德國(guó)羅氏活力型血糖儀專用試紙)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 新型白藜蘆醇納米脂質(zhì)體的制備及其性質(zhì)考察 參考Caddeo等[10]報(bào)道的白藜蘆醇脂質(zhì)體的制備方法。將白藜蘆醇2.5 mg，混合磷脂S75 120 mg、油酸12 mg加入到1 ml ATX Tris 緩沖液，避光過(guò)夜，形成混合溶液，將上述溶液在冰浴條件下應(yīng)用超聲勻漿機(jī)進(jìn)行超聲處理，形成載藥脂質(zhì)體(2.5 mg/ml)。超聲條件：持續(xù)超聲5 s，停2 s，連續(xù)循環(huán)45次，超聲探頭振幅13 μm，所有操作均在避光條件下進(jìn)行。按照上述方法制備空白脂質(zhì)體白藜蘆醇溶液：將白藜蘆醇2.5 mg、油酸12 mg加入到1 ml ATX Tris 緩沖液避光過(guò)夜形成混合溶液，然后將上述溶液在冰浴條件下應(yīng)用超聲勻漿機(jī)進(jìn)行超聲處理，形成白藜蘆醇溶液(2.5 mg/ml)。超聲條件：持續(xù)超聲5 s，停2 s，連續(xù)循環(huán)45次，超聲探頭振幅13 μm。

白藜蘆醇脂質(zhì)體的性狀考察：采用透射電子顯微鏡考察載藥脂質(zhì)體表觀形態(tài)，應(yīng)用動(dòng)態(tài)光衍射法測(cè)定載藥及空白脂質(zhì)體的粒徑和Zeta電位分布。

包封率是評(píng)價(jià)載體性質(zhì)的重要指標(biāo)。包封率測(cè)定方法簡(jiǎn)述如下：將上述制備載藥脂質(zhì)體溶液放入透析袋(截留分子量12～14 kD)，室溫透析2 h，除去未包封藥物及其他制備輔料。甲醇破壞脂質(zhì)體，應(yīng)用HPLC測(cè)定載藥脂質(zhì)體中藥物含量。

載體包封率=載藥脂質(zhì)體中藥物含量/最開(kāi)始加入藥物×100%

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只雄性健康SD大鼠(180～220 g)進(jìn)行隨機(jī)分組：正常對(duì)照組15只(control)、糖尿病組15只(DM)、白藜蘆醇溶液組15只(1 ml/kg)、白藜蘆醇脂質(zhì)體組15只(1 ml/kg)。

1.3.3 糖尿病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立及給藥方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行隨機(jī)分組后維持飼養(yǎng)1周，1周后進(jìn)行Ⅰ型糖尿病動(dòng)物模型的建立。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物腹腔注射1%鏈脲佐菌素STZ (70 mg/kg)，對(duì)照組動(dòng)物腹腔注射同劑量生理鹽水。于注射后第3、7、14天尾靜脈取血測(cè)定血糖。3次測(cè)定結(jié)果均>16.7 mmol/L且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物明顯出現(xiàn)多飲、多食、多尿以及體重下降等現(xiàn)象即說(shuō)明造模成功。此后白藜蘆醇干預(yù)組動(dòng)物尾靜脈給藥白藜蘆醇脂質(zhì)體或白藜蘆醇溶液(1 ml/kg)，每周2次持續(xù)給藥12周。糖尿病組、正常對(duì)照組動(dòng)物每周給予同劑量生理鹽水。12周后處死大鼠取材，剩余心肌細(xì)胞-80 ℃保存。

1.3.4 透射電鏡檢查 取各組大鼠左心室組織標(biāo)本(1 mm3)，經(jīng)新鮮配置的多聚甲醛+戊二醛4 ℃ 前固定1 h，PBS反復(fù)洗滌，鋨酸后固定2 h；梯度酒精脫水，環(huán)氧樹脂Epon812包埋，LKB-1型超薄切片機(jī)切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡JEM-1230(JEOL，Tokyo，Japan)下觀察拍照。

1.3.5 心肌細(xì)胞TUNEL染色 按照羅氏TUNEL凋亡試劑盒說(shuō)明書，將組織切片脫蠟、酒精梯度浸洗，Proteinase K工作液透化，在切片上加TUNEL反應(yīng)液，蓋膜，37 ℃孵育60 min，PBS緩沖液沖洗3次，DAB室溫顯色10 min，PBS沖洗3次，每次5 min，酒精梯度脫水、透明和封片，于光鏡下觀察，每只大鼠3張切片，每個(gè)切片隨機(jī)計(jì)數(shù)無(wú)重疊具有代表性的5個(gè)400倍視野，以平均每100個(gè)細(xì)胞核中含凋亡細(xì)胞的數(shù)量作為心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(Apoptosis Index，AI)。

1.3.6 Western blot技術(shù)檢測(cè) 將組織從-80 ℃冰箱中取出，在裂解緩沖液中勻漿，4 ℃離心，取上清，高速離心，沉淀用1 ml Triton X-100緩沖液溶解，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度備用。

每組按20 μg蛋白的溶液體積上樣，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓設(shè)為90 V，根據(jù)Maker移動(dòng)情況適時(shí)終止電泳。進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜，加入1∶5 000 稀釋的AKT及PAKT一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，加二抗室溫孵育1 h。以β-actin為參照，DAB顯色后應(yīng)用凝膠成像分析儀分析。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇載藥脂質(zhì)體的質(zhì)量表征 脂質(zhì)體透射電鏡觀察結(jié)果顯示，空白、載藥脂質(zhì)體均呈現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的橢球型，且表面光滑無(wú)黏連、粒徑約100 nm，載藥前后無(wú)明顯變化。動(dòng)態(tài)光衍射法測(cè)定載體粒徑及Zeta電位結(jié)果顯示，空白、載藥納米脂質(zhì)體的平均粒徑分別為(95.43±2.1)nm、(101.34±3.2) nm。多分散系數(shù)PI值分別為0.103、0.110(均<0.2)。同時(shí)，Zeta電位測(cè)定結(jié)果顯示，空白、載藥納米脂質(zhì)體分別為(-25.3±1.8)、(20.6±1.6) mV。包封率測(cè)定結(jié)果顯示，載藥納米脂質(zhì)體的包封率為90.76%±2.13%。見(jiàn)圖1。

2.2 大鼠心肌透射電鏡檢查結(jié)果 各實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌組織透射電鏡檢查結(jié)果見(jiàn)圖2，與正常對(duì)照大鼠比較，未經(jīng)任何形式干預(yù)的糖尿病組大鼠的心肌肌絲、肌原纖維的Z線(Z-line)都出現(xiàn)了嚴(yán)重的溶解、破壞，心肌細(xì)胞的線粒體出現(xiàn)明顯的空泡化。經(jīng)過(guò)白藜蘆醇溶液干預(yù)后，糖尿病大鼠心肌細(xì)胞仍存在明顯損傷，接近糖尿病大鼠，而白藜蘆醇脂質(zhì)體干預(yù)后，大鼠的心肌細(xì)胞肌絲、Z線完整，線粒體結(jié)構(gòu)飽滿，心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)基本接近正常對(duì)照組。

圖1 透射電鏡觀察空白及載藥納米脂質(zhì)體

2.3 心肌細(xì)胞的TUNEL凋亡染色結(jié)果 正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核呈棕褐色，箭頭所示為凋亡心肌細(xì)胞的細(xì)胞核。與正常對(duì)照組大鼠比較，未經(jīng)任何形式干預(yù)的糖尿病組動(dòng)物及經(jīng)過(guò)白藜蘆醇溶液干預(yù)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高(P<0.05)。與糖尿病組及白藜蘆醇溶液干預(yù)組比較，經(jīng)過(guò)白藜蘆醇脂質(zhì)體干預(yù)組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著下降(P<0.05)，接近正常對(duì)照組水平。見(jiàn)圖3。

2.4 心肌組織Western blot分析結(jié)果 各組實(shí)驗(yàn)大鼠心肌PAKT、AKT蛋白Western blot檢查結(jié)果如圖4所示。與正常對(duì)照組比較，未經(jīng)任何藥物干預(yù)的糖尿病組大鼠及經(jīng)過(guò)白藜蘆醇溶液組干預(yù)大鼠心肌PAKT/AKT含量顯著下降(P<0.01)。與糖尿病組大鼠及白藜蘆醇溶液組比較，經(jīng)過(guò)白藜蘆醇脂質(zhì)體治療干預(yù)的大鼠心肌PAKT/AKT含量升高(P<0.05)，接近正常大鼠水平。

圖2 透射電鏡觀察各組大鼠的心肌超微結(jié)構(gòu)(n=15)

圖3 各實(shí)驗(yàn)組大鼠TUNEL凋亡染色結(jié)果(n=15)

圖4 Western blot 檢測(cè)各組大鼠心肌PAKT及AKT的表達(dá)(n=15)

注：1.正常對(duì)照組，2.糖尿病組，3.白藜蘆醇溶液組，4.白藜蘆醇脂質(zhì)體組。與正常對(duì)照組、白藜蘆醇溶液組比較，*P<0.01

3 討論

糖尿病心肌病是指糖尿病患者心肌細(xì)胞原發(fā)性損傷引起的一種嚴(yán)重的并發(fā)癥，其致病因子復(fù)雜，病理特征多樣，主要包括心肌細(xì)胞肥大、凋亡及纖維化、心功能障礙等[12-13]，最終導(dǎo)致患者死亡，目前沒(méi)有有效的防治方法。已有研究證實(shí)，DCM導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡可以引起糖尿病患者心臟收縮、舒張單元減少，造成心臟重構(gòu)，最終導(dǎo)致左心室功能紊亂[14]。因此，降低糖尿病患者的心肌細(xì)胞凋亡水平有望提高患者的心功能，實(shí)現(xiàn)DCM的防治功能。

白藜蘆醇是一類非黃酮類多酚化合物，具有清除自由基、抗氧化[15]，減少高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷等作用[16-17]。但是由于白藜蘆醇存在穩(wěn)定性差、溶解度低等問(wèn)題，限制了其在體應(yīng)用。本次研究在前期研究基礎(chǔ)上應(yīng)用新型納米脂質(zhì)體包載白藜蘆醇，在體考察其對(duì)于糖尿病心肌病引起的心肌細(xì)胞凋亡的預(yù)防作用及其機(jī)制。

透射電鏡觀察結(jié)果證實(shí)，本次實(shí)驗(yàn)制備的載藥納米脂質(zhì)體形態(tài)圓整，粒徑在100 nm左右，無(wú)黏連，且載藥、空白脂質(zhì)體的多分散指數(shù)均<0.2，說(shuō)明載體粒徑分布均勻；另外，載體的Zeta電位測(cè)定結(jié)果顯示，載藥及空白脂質(zhì)體的Zeta絕對(duì)值均>15 mV，說(shuō)明載藥、空白脂質(zhì)體穩(wěn)定性好；包封率測(cè)定結(jié)果也顯示，載藥脂質(zhì)體對(duì)于白藜蘆醇的包封率高達(dá)90.76%±2.13%，說(shuō)明本次研究制備的脂質(zhì)體能夠較好地實(shí)現(xiàn)對(duì)于難溶性藥物白藜蘆醇的包載，提高其溶解度及穩(wěn)定性。

未經(jīng)任何形式藥物干預(yù)的糖尿病組及白藜蘆醇溶液干預(yù)組大鼠12周后心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，線粒體呈明顯的空泡化，心肌肌纖維及Z線斷裂、溶解。而經(jīng)過(guò)白藜蘆醇脂質(zhì)體干預(yù)后，大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)明顯好轉(zhuǎn)，空泡化的線粒體數(shù)量明顯減少，心肌肌纖維及Z線清晰，連貫，心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)接近正常對(duì)照組細(xì)胞，說(shuō)明白藜蘆醇脂質(zhì)體干預(yù)能夠有效保護(hù)心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，減少因?yàn)楦咛且鸬男募〖?xì)胞損傷。同時(shí)TUNEL凋亡染色結(jié)果也證實(shí)，與正常對(duì)照組比較，未經(jīng)任何形式藥物干預(yù)的糖尿病組及白藜蘆醇溶液干預(yù)組大鼠12周后，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)升高(P<0.05)，而經(jīng)過(guò)白藜蘆醇脂質(zhì)體干預(yù)后，大鼠的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著下降(P<0.01)，說(shuō)明白藜蘆醇脂質(zhì)體能夠有效預(yù)防糖尿病心肌病引起的心肌細(xì)胞凋亡。

為了研究白藜蘆醇對(duì)于預(yù)防糖尿病心肌病心肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，本研究應(yīng)用Western blot分析各實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌細(xì)胞AKT、PAKT蛋白含量。AKT作為凋亡相關(guān)通路PI3K/AKT的下游蛋白，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。AKT影響細(xì)胞的多種功能，包括細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、新陳代謝等。已有研究證實(shí)，作為AKT的一種活化形式，PAKT(磷酸化的AKT)能夠顯著降低缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞凋亡[18]。同時(shí)，PAKT蛋白的表達(dá)下降與心力衰竭、心功能障礙密切相關(guān)[19]。本研究證實(shí)，與正常對(duì)照組比較，未經(jīng)任何藥物干預(yù)及經(jīng)過(guò)單純白藜蘆醇溶液干預(yù)的糖尿病大鼠心肌細(xì)胞PAKT/AKT比值降低(P<0.05)，而經(jīng)過(guò)白藜蘆醇脂質(zhì)體干預(yù)后，PAKT/AKT的比值升高(P<0.05)，說(shuō)明白藜蘆醇脂質(zhì)體能夠激活A(yù)KT蛋白，通過(guò)PI3K/AKT途徑調(diào)控糖尿病心肌病引起的心肌細(xì)胞損傷。

綜上所述，應(yīng)用新型納米脂質(zhì)體包載白藜蘆醇后，能夠激活PI3K/AKT信號(hào)通道，實(shí)現(xiàn)對(duì)于糖尿病心肌病致心肌細(xì)胞凋亡的預(yù)防作用，為臨床糖尿病心肌病患者的防治提供了一種新的思路。而單純的白藜蘆醇溶液沒(méi)有顯著效果，大鼠應(yīng)用白藜蘆醇溶液后，其內(nèi)環(huán)境的影響改變了白藜蘆醇溶液組成，使得白藜蘆醇在體內(nèi)重新析出成為難溶性物質(zhì)，從而無(wú)法發(fā)揮應(yīng)有的效果，有待后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)研究。